Цель курса биохимии — научить будущих врачей применять при изучении последующих дисциплин и в профессиональной врачебной деятельности сведения о химическом составе и молекулярных процессах организма как о характеристиках нормы и признаках патологии. Исходя из этого, в предлагаемом издании особое внимание уделяется сведениям о непосредственной связи молекулярных процессов с физиологическими (биологическими) функциями клетки и организма. Например, с этой точки зрения один из центральных вопросов общей биохимии — о механизмах ферментативного катализа — представляется нам менее важным, чем вопрос о субстратной специфичности и многообразии ферментов в организме.
Сведения о молекулярных механизмах патогенеза болезней, имеющиеся в каждой главе, выполняют не только информативную, но и мотивационную роль, поскольку подчеркивают значение биохимии для изучения клинических дисциплин и для будущей профессиональной деятельности. Вместе с тем биохимия должна сохранять характер фундаментальной дисциплины, составляя вместе с другими медико-биологическими дисциплинами теоретическую основу медицины.
Как используется знание медико-биологических дисциплин в практической деятельности врача? Установление диагноза болезни и назначение адекватного лечения включают ряд мыслительных операций, начиная с отбора симптомов из многих тысяч диагностических признаков, известных современной медицине. Отобранные симптомы складываются в клиническую картину, на основе которой делают заключение о сущности болезни и, наконец, устанавливают диагноз страдания конкретного больного, служащий базой для определения методов лечения. При этом мысль врача постоянно возвращается от последующего этапа к предыдущему и корректируется путем сопоставления промежуточных заключений. Центральную роль в этом процессе играют образы сущности болезней, имеющиеся в памяти врача. Они служат главным ориентиром и в движении к диагнозу, и в движении от диагноза к способам лечения. А сущности болезней, равно как мишени и механизмы действия лекарств и лечебных мероприятий, описываются в терминах и понятиях морфологии, физиологии и биохимии. При этом клиницисту требуется интегральное описание морфологии, физиологии и биохимии патологических состояний: нет такой функции и нет такой болезни, которые можно было бы описать в рамках одной или двух из этих дисциплин.
При составлении книги мы стремились подбирать такие факты, конкретные явления, частные приложения биохимии, на основе которых проще перейти к обобщениям, чтобы, исходя из них, можно было понимать и конструировать другие конкретные явления того же класса, составляющие содержание биохимии. Такой подход позволяет решить и проблему, связанную со старением информации. Современный врач вынужден не только знать тонкости своего дела, но и уметь ориентироваться в быстро меняющейся информационной обстановке. Знание основных концепций, закономерностей и методов биохимии помогает студенту (врачу) находить и понимать новую информацию по биохимии и применять ее для решения медицинских проблем.
При написании книги мы исходили из того, что будущие врачи, начинающие изучать биохимию, имеют запас знаний о молекулах и молекулярных процессах, полученный в средней школе и в курсах химических дисциплин, предшествующих или параллельных курсу биохимии. Поэтому мы в ряде случаев нарушали логику изложения химизма биохимических процессов, чтобы сохранить логику изложения их биологического смысла и значения.
Для читателя важно помнить, что в каждом очередном разделе содержится больше информации, чем можно извлечь при первом чтении, основываясь на знании только предшествующих разделов. Это обычная ситуация при описании сложных кооперативных систем, в которых все части образуют единое функциональное целое. Именно к таким системам относятся объекты биологии, в том числе биохимия человека.
Настоящее издание отражает результат многолетней эволюции преподавания биохимии в ММА. При подготовке нового издания учтены многочисленные и существенные изменения содержания биохимии за последние годы. В соответствии с этим внесены значительные изменения и в структуру учебника.
Первичной структурой называют порядок чередования (последовательность) аминокислотных остатков в белке. Даже идентичные по длине и аминокислотному составу пептиды могут быть разными веществами. Например, из двух аминокислот — аланина и тирозина — можно построить два пептида: Ala—Туг и Туг—Ala. Из трех аминокислот можно получить шесть различных по первичной структуре трипептидов. Число изомеров полипептида, построенного из п разных аминокислот, равно числу перестановок из п элементов, т. е. п\ При п = 20 число возможных изомеров равно 2«1018. Если учесть, что в составе пептидной цепи каждая из аминокислот может встречаться больше одного раза, то число изомеров становится невообразимым. Возможность составления разных белков из аминокислот так же неисчерпаема, как возможность составления разных фраз из букв алфавита. Однако в живой природе реализуются не все эти возможности. В организме человека, по приближенным оценкам, имеется около 50 ООО разных белков.После реакции выделяют ФТГ—к и идентифицируют его; допустим, он оказался фенилтиогидантоином аланина. Теперь мы можем записать последовательность исследуемого тетрапептида так: Ala—1—m—п. Затем таким же образом исследуют оставшийся после первой реакции трипептид 1—m—п и узнают второй аминокислотный остаток, и т. д. Созданы автоматические приборы — секвенато-ры, позволяющие с использованием этой реакции изучать первичную структуру карбоксильной группой метионина и аминогруппой любой другой аминокислоты. При обработке бромцианом в молекуле белка разрушаются все такие связи и образуется соответствующее число фрагментов. Для фрагментирования применяют также некоторые ферменты, избирательно гидролизующие определенные пептидные связи.
Характерная структурная особенность фибриллярных белков — вытянутая, нитевидная форма молекул. Эти белки нерастворимы в воде и часто образуют многомолекулярные нитевидные комплексы — фибриллы.
Фибриллярный белок коллаген — самый распространенный белок в мире животных; в организме человека с массой тела 70 кг содержится от 12 до 15 кг белков, и половина этого количества приходится на коллаген. Молекула коллагена (тропоколлагена) построена из трех пептидных цепей, каждая из которых содержит около 1000 аминокислотных остатков. Необычен аминокислотный состав коллагена: каждая третья аминокислота — это глицин, 20 % составляют остатки пролина и гидроксипролина, 10 % — аланина, остальные 40 % представлены всеми другими аминокислотами. Коллаген — единственный белок, в котором содержится гидроксипролин. Эта аминокислота получается путем гидроксилирования части остатков пролина уже после образования пептидных цепей. Гидроксилиру-ется также некоторая часть остатков лизина с превращением в гидроксилизин.Каждая из пептидных цепей коллагена имеет конформацию спирали, отличающейся от а-спирали; в молекуле коллагена все'три спирали, в свою очередь, перевиты друг с другом, образуя плотный жгут (рис. 1.28). Между спиралями за счет пептидных групп образуются водородные связи (—C=0**«H—N—). Такие же водородные связи имеются и внутри каждой цепи.Молекулы коллагена, соединяясь «бок о бок», образуют микрофибриллы (см. рис. 1.28); из микрофибрилл формируются более толстые фибриллы, а из них — волокна и пучки волокон. Связи между молекулами коллагена в фибриллах ковалентные; они возникают за счет взаимодействия оксилизиновых остатков. В организме человека содержится не менее 19 разных типов коллагена. Коллагеновые волокна вместе с другими полимерными веществами межклеточного матрикса составляют основу соединительной ткани, обеспечивающую ее опорную функцию (гл. 18).
Эпидермис кожи, волосы, ногти содержат фибриллярные белки кератины. Пептидные цепи этих белков имеют конформацию а-спирали. В волосе три такие цепи, скрученные в суперспираль, образуют первичный агрегат (протофибриллу). Спиральный жгут из нескольких протофибрилл представляет собой микрофибриллу, жгут из микрофибрилл — макрофибриллу. В целом получается структура многожильного каната. В одном волосе содержатся сотни макрофибрилл, ориентированных по длине волоса. Молекулы кератина в макрофибрилле соединены друг с другом дисульфидными связями, что придает прочность и жесткость всей структуре.
Фибриллярные белки нерастворимы в воде. Они не перевариваются в пищеварительном тракте большинства животных и человека и поэтому не могут служить пищей (однако некоторые виды членистоногих, например моль и др., приспособились к питанию фибриллярными белками шерсти, кожи, перьев птиц).
Нет сомнений, что белки выполняют в живой клетке наиболее разнообразные и наиболее интересные функции. Как уже было отмечено, в организме человека количество разных белков исчисляется десятками тысяч. Каждый белок имеет уникальную, свойственную лишь ему структуру и в такой же мере уникальную функцию, отличающуюся от функций всех других белков. Некоторые белки можно объединить в группы по признаку сходства их функций:1. Транспортные белки: гемоглобин, сывороточный альбумин, трансферрин и др.; белки трансмембранного транспорта.
2. Ферменты.
3. Белки-регуляторы: белковые гормоны, белки, регулирующие действие генов, белковые ингибиторы и активаторы ферментов и других белков.
4. Структурные белки: белки нуклеосом, соединительной ткани, фибрин тромбов.
5. Защитные белки (иммуноглобулины).
6. Сократительные белки.
7. Белки, предназначенные для питания развивающегося зародыша (форма запасания аминокислот): казеин молока, овальбумин яиц, запасные белки семян растений.
Белок, выполняющий определенную функцию в живой клетке, может быть представлен несколькими формами — изофункциональными белками, или изобелка-ми. Например, в эритроцитах человека обнаружено несколько форм гемоглобина: у взрослого человека преобладающими формами являются НЬА, на долю которого приходится 96 % всего гемоглобина, HbF и НЬА^ (примерно по 2 % каждого). Все гемоглобины представляют собой тетрамеры, построенные из разного набора протомеров а, р, у и 8: формула НЬА — 2а2(3, HbF — 2осу, НЬА2 — 2ос28. Общим для всех гемоглобинов является наличие а-протомеров. Разные протомеры сходны между собой по первичной структуре, и очень большое сходство между протомерами наблюдается по вторичной и третичной структурам. Все формы гемоглобинов выполняют одинаковую функцию — присоединяют кислород в легких и передают его в клетки тканей. Однако в какой-то мере по функциональным свойствам формы гемоглобинов различаются.HbF характерен для эмбриональной стадии развития человека (фетальный гемоглобин); лишь в последние недели беременности и первые недели после рождения он постепенно заменяется на НЬА. Кровь плода и матери не смешивается; снабжение плода кислородом обеспечивается за счет диффузии кислорода из кровеносных сосудов матери в кровеносные сосуды плода в плаценте. Более высокое сродство фетального гемоглобина к кислороду делает возможной диффузию при меньшем градиенте концентраций кислорода между сосудами матери и плода.Меньшую степень родства с гемоглобинами обнаруживает миоглобин: по строению и свойству связывать кислород он очень сходен с протомерами гемоглобина, однако в отличие от гемоглобинов, циркулирующих в крови и переносящих кислород от легких (или плаценты) к тканям, миоглобин фиксирован в мышечной ткани и служит промежуточным переносчиком кислорода от гемоглобина к митохондриям, а также для создания резерва кислорода в мышцах.
Изофункциональные белки — это семейства белков, выполняющих в общем одинаковую функцию, однако небольшие особенности некоторых членов семейства могут иметь важное физиологическое значение. Изобелками называют множественные молекулярные формы белка, обнаруживаемые в организмах одного вида; белки организмов разных биологических видов, выполняющие в них одинаковые функции (гомологичные белки), не относят к изобелкам. Например, гемоглобин человека и гемоглобин кролика — это не изобелки, несмотря на их одинаковую функцию и общее эволюционное происхождение. Более точное определение изофункциональных белков дано в гл. 5. Известно большое число семейств изобелков; особенно хорошо изучены изофункциональные ферменты (см. гл. 2). Есть основания считать, что значительная часть белков организма (если не все) представлена двумя или большим количеством изофункциональных форм.
В организмах в процессе биологической эволюции, а также в технике при разработке химических технологических процессов отбирались в качестве катализаторов такие вещества, реакции с которыми протекают очень быстро — в тысячи, в миллионы, даже в 1010 раз быстрее, чем соответствующие некаталитические реакции. Такое различие скоростей позволяет вообще пренебречь некатализируемым процессом и считать, что все вещество подвергается превращению при участии катализатора. Рассмотренный выше каталитический процесс (4) составляет основу нитрозного метода получения серной кислоты; скорость этого процесса настолько выше скорости некаталитической реакции (1), что практически все молекулы S02 превращаются в молекулы S03 при участии N02, т. е. вкладом реакции (1) в образование продукта можно пренебречь. В организме человека ежесуточно распадается около 0,5 кг глюкозы до С02 и Н20; в отсутствие катализаторов для этого при тех же физических условиях потребовалось бы около 10 ООО лет. Таким образом, и в этом случае можно считать, что практически вся глюкоза в организме распадается в катализируемых реакциях.
Рассмотренный выше пример катализа (синтез S03) представляет собой кова-лентный катализ: катализатор образует ковалентное соединение с исходным веществом. Существует и нековалентный катализ: в этом случае катализатор соединяется с реагентами за счет слабых взаимодействий, например адсорбционных. Однако во всех случаях общим для катализа является то, что катализатор открывает новый путь превращения вещества через новые промежуточные состояния в те же продукты, которые могут образоваться и без катализатора. В реакциях, катализируемых ферментами, в промежуточных продуктах возникают как ковален-тные, так и нековалентные связи.
Для выделения ДНК из экстракта тканей белки экстракта разрушают протеаза-ми, ДНК осаждают этанолом и осадок растворяют в буферном растворе. Как уже отмечалось, молекулы ДНК имеют очень большие размеры: молекула среднего размера из клеток человека содержит примерно 150 млн нуклеотидных пар, ее длина равна 4 см, отношение длины к толщине равно 3106 (толщина двойной спирали ДНК 20 нм). Такие молекулы очень чувствительны к сдвиговым усилиям, возникающим в растворе, поэтому в процессе выделения из тканей ДНК фрагментирует-ся, и получаются молекулы размером в тысячи-десятки тысяч нуклеотидных пар. Таким образом, каждая молекула среднего размера распадается на 15 000-150 000 фрагментов. Но и такого размера молекулы неудобны для исследования, и их приходится фрагментировать дополнительно.Для фрагментирования ДНК обычно используют ферменты рестриктазы, выделяемые из бактерий. В отличие от других ДНКаз, рестриктазы узнают определенную нуклеотидную последовательность в двухцепочечной молекуле ДНК, часто из четырех или шести нуклеотидных пар, присоединяются к ней и гидролизуют по одной 3',5'-фосфодиэфирной связи в каждой из цепей в области этих последовательностей. Разные рестриктазы узнают разные последовательности (рис. 3.10), и с помощью набора рестриктаз можно разрезать молекулу ДНК на фрагменты желаемой длины и в местах, выбранных экспериментатором.
Если ДНК человека разрезать с помощью рестриктаз на фрагменты длиной 4000 нуклеотидов, то получится около 1 млн фрагментов. Как в такой груде найти и извлечь из нее искомый фрагмент? Это можно сделать, используя ДНК-зонды. Зонды представляют собой фрагменты одноцепочечной ДНК длиной около 20 нуклеотидов, содержащие радиоактивную (например, 32Р) или другую метку. Нук-леотидная последовательность зонда должна быть комплементарна какой-то части искомого фрагмента ДНК. Зонд вносят в раствор фрагментов ДНК, смесь нагревают для денатурации ДНК, затем охлаждают для ренативации ДНК. При этом часть искомых фрагментов соединится с зондом, таким образом искомый ген окажется меченым (рис. 3.16). Затем смесь разделяют электрофорезом и по наличию радиоактивной метки находят нужный фрагмент. РНК тоже можно использовать в качестве зонда.Нуклеиновые кислоты в живой клетке находятся в форме нуклеопротеинов — соединений с белками. Лишь тРНК обнаруживается преимущественно в свободно растворенном состоянии в цитозоле. Основные нуклеопротеиновые структуры — это хроматин (дезоксирибонуклеопротеин) и рибосомы (рибонуклеопротеин).
Структурная организация хроматина сложна и изучена далеко не полностью. Состояние хроматина изменяется в зависимости от клеточного цикла. В фазе покоя (время интерфазы) хроматин равномерно распределен по всему объему ядра и не обнаруживается обычными микроскопическими методами. В фазе деления клетки хроматин образует компактные частицы, хромосомы*, которые видны в обычный микроскоп.
Примерно 2/3 массы хроматина составляют белки, 1/ъ — ДНК. Хроматин содержит также РНК (до 10 %). Половина всех белков хроматина — это гистоны, другая половина — негистоновые белки.
Гистоны представляют собой белки с молекулами сравнительно небольшого размера (молекулярная масса 11 000-22 ООО). Различают нуклеосомные гистоны (их четыре типа — Н2А, Н2В, НЗ, Н4) и линкерный гистон HI. Характерная особенность гистонов — высокое содержание лизина и (или) аргинина; это придает им щелочной характер и способность взаимодействовать с кислотными группами ДНК.
На электронно-микроскопических фотографиях хроматина видны образования, напоминающие бусины, нанизанные на нитку (рис. 3.17). Каждая бусина содержит 8 молекул нуклеосомных гистонов и прилегающую к ним петлю ДНК длиной около 150 нуклеотидных пар (примерно полтора витка вокруг гистонов). Такую структуру называют нуклеосома (рис. 3.18). В межнуклеосомных (линкерных) участках к ДНК присоединена молекула гистона HI.
При такой укладке (компактизации) молекулы ДНК занимают места (в длину) примерно в 7 раз меньше по сравнению с вытянутой молекулой. Кроме того, гистоны защищают ДНК от действия нуклеаз. Нуклеосомная структура — это лишь первый уровень укладки ДНК. Длина молекул ДНК человека измеряется сантиметрами (от 2 до 6 см), а длина хромосом — всего несколько микрометров. Следовательно, степень укорочения (компактиза-ции) ДНК при укладке в хромосомы должна достигать нескольких тысяч. Это происходит в результате дополнительного скручивания нуклеосомной нитки бус. Высшие уровни укладки ДНК изучены недостаточно.
Митотический клеточный цикл описывает изменения клеток в процессе их размножения (пролиферации). При этом выделяют фазы, которые можно различить и морфологически, и по особенностям биохимических процессов (рис. 4.7, а).Зрелые соматические клетки человека диплоидны, т. е. содержат две копии генома (фазы и G0). Во время фазы S происходит репликация ДНК: каждая из копий генома удваивается, и клетка становится тетраплоидной.
Во время митоза (М) происходит конденсация хроматина и образование хромосом (тетраплоидного набора), а при последующем делении клетки образуются диплоидные дочерние клетки. Во время фазы Gx синтезируются РНК и белки, обеспечивающие рост клетки. Клетки, подвергшиеся дифференцировке, уже не участвуют в клеточном цикле и могут долго оставаться в таком состоянии (фаза покоя G0). Однако определенные агенты, стимулирующие клеточный цикл (мито-генные сигналы), могут вернуть такие клетки в фазу Gl и в клеточный цикл. Например, клетки печени в норме находятся в фазе GQ. После удаления части печени оставшиеся клетки стимулируются митогенами и вступают в клеточный цикл: масса печени увеличивается до нормальной.
В переключении фаз клеточного цикла участвуют белки циклины и циклинза-висимые протеинкиназы. Переход каждой фазы цикла в следующую фазу регулируется специфическими для данной фазы циклинами и протеинкиназами. При подготовке к очередной фазе количество соответствующего циклина в клетке нарастает, а после завершения фазы резко падает до нуля. Например, в часы, предшествующие митозу, в клетке нарастает концентрация циклина В. Циклин В соединяется с неактивной формой циклин В зависимой протеинкиназы и активирует ее. В свою очередь, активная протеинкиназа фосфорилирует и тем самым активирует ряд ферментов и других белков, необходимых для митоза (в частности, белки, участвующие в образовании митотического веретена и в расхождении хромосом).
Каждый ориджин и, соответственно, каждый репликон должен сработать один раз за один клеточный цикл. Полная картина механизма, который регулирует периодичность репликации ДНК, совпадающую с периодичностью митотического цикла, пока остается неизвестной. Исследование этого вопроса составляет одну из важных задач современной биохимии, поскольку здесь может открыться путь для управления скоростью размножения клеток при заживлении ран или регенерации тканей.
Если молекулу ДНК можно рассматривать как форму записи информации, то репликация ДНК в материнской клетке и последующее распределение копий поровну между дочерними клетками — это передача информации от поколения к поколению.