Как мы видели, репликация служит для передачи информации новым поколениям. С другой стороны, информация, записанная в ДНК (в генотипе), обеспечивает образование фенотипических признаков организма, трансформируется в фенотип. Это направление потока информации имеет гораздо более сложную природу и включает два других типа матричных биосинтезов — транскрипцию и трансляцию.
Классическая генетика пользуется такими фенотипическими признаками, как окраска цветка, форма крыльев у дрозофилы, длина шерсти у овец и т. п. Такие признаки не позволяют анализировать механизм трансформации генотипа в фенотип в терминах молекулярных процессов. Но вот в 1902 г. английский врач Гар-род опубликовал исследования по алкаптонурии у человека. Для этой болезни характерно выделение с мочой значительных количеств гомогентизиновой кислоты, которая, окисляясь кислородом воздуха, образует черный пигмент. Болезнь врожденная, и ее обычно обнаруживают по появлению черных пятен на пеленках.
Гаррод установил, что алкаптонурия наследуется как рецессивный единичный, не сцепленный с другими признак. Отсюда следовал вывод, что гены контролируют простые биохимические реакции. Значительно позднее (1958 г.) выяснилась причина накопления гомогентизиновой кислоты: это вещество оказалось промежуточным продуктом распада тирозина Гомогентизиновая кислота у здоровых людей превращается в фумарилацетоук-сусную кислоту при действии оксидазы гомогентизиновой кислоты. У больных алкаптонурией этот фермент отсутствует или его активность очень низка, поэтому превращения тирозина останавливаются на этой стадии. Теперь можно было заключить, что гены контролируют синтез ферментов, и связь между геном и фе-нотипическим признаком представить следующим образом:Некоторые продукты реакции проявляются как непосредственно видимые фенотипические признаки классического типа, например пигмент цветка. Однако первым продуктом гена может быть не обязательно фермент, а любой белок, свойства которого определяют тот или иной фенотипический признак. Например, от зрительного пурпура (родопсина) сетчатки глаза зависит способность воспринимать свет, от синтеза фибриллярных белков кератинов зависит образование шерсти или рогового покрова, и т. д.
В 40-50-е годы XX в. это представление о связи между генотипом и фенотипом было экспериментально подтверждено на многих ферментах и других белках разных организмов; результаты нашли отражение в афористической формуле: один ген — один белок.
Но каким образом гены контролируют синтез белков? Можно представить два механизма: а) ген просто включает и выключает синтез белка; б) ген содержит инструкцию о строении белка.
В решении этого вопроса помогло исследование другой наследственной болезни человека — серповидно-клеточной анемии. Л. Полинг (США) в 1949 г. обнаружил, что гемоглобин таких больных отличается от гемоглобина здоровых людей по электрофоретической подвижности. Как стало ясно позднее, это различие обусловлено заменой 6Glu -* Val в р-цепи гемоглобина. Отсюда следовал вывод, что ген определяет первичную структуру белков. При этом информация, записанная с помощью определенного чередования нуклеотидных остатков, переводится в информацию, записанную чередованием аминокислотных остатков. Это можно сравнить с переводом записи, сделанной азбукой Морзе, на буквенную запись.
ДНК в клетках эукариот сосредоточена главным образом в ядре, а синтез белков обнаруживается и в частях клетки, не содержащих ДНК. Роль промежуточного переносчика информации от ДНК к местам синтеза белка выполняют рибонуклеиновые кислоты. Направление потока информации в клетке от генотипа к фенотипу представляют так: ДНК -* РНК -* белки. Иначе говоря, ДНК служит матрицей для синтеза РНК, а РНК — матрицей для синтеза белков (см. рис. 4.1). Это положение называют основным постулатом молекулярной биологии.
В результате трансляции не всегда сразу образуется функционально активный белок. Во многих случаях необходимы дополнительные посттрансляционные изменения.Например, молекула инсулина построена из двух пептидных цепей, соединенных между собой двумя дисульфидными мостиками (см. рис. 1.15). В геноме человека содержится ген препроинсулина; в результате действия этого гена образуется препроинсулин — предшественник инсулина. Синтез препроинсулина происходит на полирибосомах, связанных с эндоплазматическим ретикулумом. Препроинсулин проникает в люмен ретикулума, где от него отщепляется лидирующая последовательность — N-концевой фрагмент, содержащий 24 аминокислотных остатка. Образовавшийся проинсулин (86 остатков) перемещается в люмене к аппарату Гольд-жи, где упаковывается в секреторные гранулы. В пластинчатом комплексе и секреторных гранулах происходит превращение проинсулина в инсулин (рис. 4.19). В этом участвуют две эндопептидазы: они расщепляют связи Arg32-Glu33 и Arg65-Gly66. Затем С-концевые остатки Arg и Lys отщепляются карбоксипептидазой; этот фермент есть во многих других органах, где участвует в процессинге ряда гормонов и нейромедиаторов.Сходным образом, т. е. путем частичного протеолиза, активируются многие белки.
Присоединение простетической группы с образованием сложных белков и объединение протомеров олигомерных белков также относятся к посттрансляционным изменениям. В некоторых белках после завершения синтеза пептидной цени происходит модификация аминокислотных остатков, например превращение пролина и лизина в гидроксипролин и гидроксилизин в коллагенах, метилирование аргинина и лизина в гистонах, йодирование тирозина в тироглобулине.
Белки, как и другие компоненты клетки, находятся в динамическом состоянии, т. е. непрерывно обновляются. Это можно обнаружить в простом эксперименте. Если животному давать корм, содержащий меченые аминокислоты (14С-аминокислоты), то они включаются во вновь синтезируемые белки, и с течением времени все белки становятся мечеными. Если теперь животное перевести на обычный корм, то количество меченых белков в тканях начинает убывать. Таким способом можно определить время полужизни белка: оно равно времени, в течение которого количество метки в белке снизилось наполовину. Среднее время полужизни белков — это время, за которое белки всего организма обновляются наполовину. Можно измерить время полужизни и отдельных белков. Например, время полужизни растворимых белков печени колеблется в пределах от 12 мин до 25 дней. В табл. 4.2 приведена скорость обновления некоторых быстрообменивающихся белков печени.Печень — орган с интенсивным обменом веществ. В костях и сухожилиях полуобновление белков занимает месяцы, а то и годы. Особенно медленно обновляются фибриллярные белки — коллаген, эластин. К быстрообменивающимся белкам относятся гемоглобин, белки мышц, пищеварительные ферменты. У человека белки всего тела обновляются наполовину за 12 недель. Если скорость синтеза и скорость распада белка одинаковы, то его концентрация сохраняется постоянной (стационарное состояние).Концентрация многих белков в клетке непостоянна и изменяется в зависимости от условий, например в зависимости от количества и состава пищи, в процессе онтогенеза, при введении некоторых лекарственных веществ. Это происходит в результате регуляции скоростей синтеза и распада белков. На рис. 4.20 указаны процессы, от которых зависит концентрация белков в клетке и которые могут быть точками приложения регуляторных механизмов.
В геноме человека имеется около 50 000 белковых генов. На протяжении жизненного цикла человека, от гамет до завершения жизненного пути, все они используются, экспрессируются, но не все одновременно, а в определенном порядке и по-разному в разных типах клеток. Многоклеточные организмы построены из дифференцированных клеток, специализированных для выполнения определенных функций. В организме человека различают сотни типов дифференцированных клеток, идентичных генотипически, но различающихся фенотипически. Фенотип клетки определяется набором белков, синтезирующихся в ней: белки можно рассматривать как первичные фенотипические признаки. В дифференцированной клетке экспрессируется 5 000-15 000 генов (белков), а все остальные гены «молчат». Основная часть белков дифференцированной клетки — это белки «домашнего хозяйства», т. е. те, которые обеспечивают само существование живой клетки. К ним относятся белки, участвующие в матричных синтезах, в синтезе АТФ, мембран и др. Белки «домашнего хозяйства» составляют около 80 % всех белков дифференцированной клетки. Меньшая часть приходится на белки, не обязательные для жизнеобеспечения самой клетки, но выполняющие в организме (не в отдельной клетке!) интегральные функции. Например, альбумин, синтезируемый и секретируемый гепатоцитами, пищеварительные ферменты, белки-гормоны, гемоглобин и др. Отметим, что «молчащих» генов в дифференцированной клетке существенно больше, чем действующих.
Таким образом, можно выделить два типа регуляции действия генов в клетках животных.
1. В дифференцированной клетке большая часть генов — около 80 % — полностью выключена, репрессирована, и это состояние сохраняется длительно, часто на протяжении всей жизни клетки или даже многих генераций клетки.
2. Интенсивность действия невыключенных генов регулируется путем индукции или репрессии. Сигналом для увеличения или уменьшения скорости синтеза белков служит изменение концентрации определенного вещества — гормона, некоторых метаболитов и др. Такие изменения обычно непродолжительны, и клетка возвращается в базальное состояние после прекращения действия сигнала.
Набор действующих и выключенных генов различен в дифференцированных клетках разных типов; различия возникают в ходе клеточной дифференцировки и определяют фенотип клетки. Молекулярные механизмы регуляции такого типа пока неизвестны. Изучение биохимии клеточной дифференцировки составляет одно из основных направлений современной биохимии; оно имеет важное значение для медицины, поскольку может открыть средства управления процессами регенерации поврежденных или даже утраченных органов.
Напомним, что соматические клетки человека содержат диплоидный набор хромосом — 22 пары аутосомных и одну пару половых: XX — у женщин и XY — у мужчин, всего 46 хромосом. В яйцеклетках и сперматозоидах содержится гаплоидный набор — 23 хромосомы. Из них 22 хромосомы одинаковые у мужчин и женщин (аутосомные хромосомы), а 23-я хромосома X — у женщин и Y — у мужчин. Ауто-сомные хромосомы нумеруются от 1 до 22 в порядке уменьшения размера.
Общая длина всех молекул ДНК гаплоидного набора составляет 3*109 н. п., или 1 м. Полная запись генома человека с использованием однобуквенных символов (AGCAAT...) заняла бы около 1000 томов по 1000 страниц каждый и 3000 знаков на странице. В каждой хромосоме содержится одна молекула ДНК. В хромосоме 21 (самая маленькая хромосома в геноме человека) молекула ДНК содержит 50 000 000 н. п., длина ее равна 1,5 см. Длина молекулы ДНК в хромосоме среднего размера равна примерно 130 000 000 н. п., или 4 см (в записи однобуквенными символами — 45 томов).Небольшое количество ДНК содержится в митохондриях — меньше 1 % от всей ДНК. Митохондриальная ДНК наследуется по материнской линии, поскольку митохондрии сперматозоидов не проникают в яйцеклетку.
Геном Е. coli в 1000 раз меньше генома человека (один том однобуквенной записи).
Генами называют участки ДНК, кодирующие синтез тРНК, рРНК и мРНК. Гены, кодирующие синтез мРНК, называют также генами белков. На их долю приходится лишь около 10 % всей ДНК клетки (100 томов однобуквенной записи). Регуляторные последовательности занимают не много места. Функции остальной ДНК (почти 90 %) большей частью неизвестны; значительная часть ее представлена многократно повторяющимися, тандемно расположенными нукле-отидными последовательностями.
Для каждой из 60-ти индивидуальных тРНК имеется от 10 до 20 копий гена. Гены рРНК образуют тандемы повторяющихся звеньев, каждое из которых содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие 28S-, 18S- и 5,8S- рРНК. Число таких повторов в геноме человека равно примерно 160-ти. Располагаются они в области ядрышковых организаторов пяти пар хромосом — 13, 14, 15, 21 и 22. Гены 5S-pPHK находятся на хромосоме 1, образуя тандем примерно из 2000 генов.
Число разных генов мРНК, т. е. генов, кодирующих разные белки, в клетках человека около 50 000. В гаплоидном наборе некоторые из индивидуальных генов мРНК представлены единственной копией, другие — двумя или несколькими копиями, и есть такие, число копий которых исчисляется сотнями (например, гены гистонов). Гены мРНК обычно имеют размеры в пределах 1000-1 000 000 н. п.
Библиотека ДНК человека
Одной из задач изучения генома является создание библиотеки ДНК человека. Под библиотекой ДНК подразумевают коллекцию клонированных (размноженных) фрагментов ДНК организма. Такими фрагментами могут быть гены, промоторы, энхансеры, сайленсеры и др. Одновременно создаются две формы библиотеки: 1) геномная библиотека, содержащая копии всех без исключения участков (нуклеотидных последовательностей) генома; 2) библиотека комплементарной ДНК, содержащая только те последовательности, которые комплементарны какой-либо из мРНК. Следовательно, эта библиотека не содержит регуляторных и других нетранскрибируемых последовательностей (напомним, что на их долю приходится около 90 % всей ДНК); кДНК не содержит также интронов. Полная библиотека генома человека является необходимой базой как для изучения функционирования генов, так и для решения прикладных проблем, прежде всего медицинских.
Инкубационная смесь содержит буферный раствор, препарат фрагментирован-ной ДНК, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, ДНК-полимеразу и две разные затравки.
В ПЦР используется ДНК-полимераза из термофильной бактерии Thermns aqnaticus (Taq-полимераза), обитающей в природных горячих источниках. Этот фермент отличается высокой устойчивостью к повышенной температуре.
Если ДНК человека разрезать с помощью рестриктаз на фрагменты длиной 2000 нуклеотидов (это близко к среднему размеру генов), то получится около 2 млн фрагментов. Найти в такой груде изучаемый ген можно, используя специальные затравки. Затравки представляют собой фрагменты одноцепочечной ДНК длиной около 20 нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность одной затравки должна быть комплементарна З'-концу одной цепи искомой последовательности ДНК, а второй затравки — З'-концу другой цепи этой последовательности (рис. 4.24, цикл 1). Затравки в ПЦР функционируют как собственно затравки (см. рис. 4.4), а главное — как зонды, обнаруживающие и метящие изучаемую последовательность в молекуле ДНК. Если ставится задача поиска гена белка, то такие затравки можно синтезировать, исходя из генетического кода и аминокислотной последовательности N- и С-концов белка. Эти затравки найдут в массе фрагментов суммарной ДНК тот фрагмент, который содержит искомый ген, а ДНК-полимераза синтезирует новые копии гена.
Реакция проходит в три стадии (рис. 4.24).
1. Инкубационную смесь нагревают до 90 °С. При этом происходит денатурация ДНК, из одной двухцепочечной молекулы образуются две одноцепо-чечные.
2. Инкубационную смесь охлаждают до 50 °С. При этом происходит гибридизация цепей с затравками.
3. Инкубационную смесь нагревают до 70 °С. При этой температуре гибридные молекулы не денатурируются, а ДНК-полимераза удлиняет обе затравки с их З'-концов до 5'-концов матричных цепей. В результате образуются две новые цепи ДНК, укороченные с 5'-концов; при этом затравка оказывается включенной в эти укороченные цепи молекул ДНК.
Концентрация каждой затравки должна значительно превышать концентрацию ДНК. В противном случае во время стадии 2 высока вероятность того, что разделенные цепи ДНК будут соединяться не с затравкой, а друг с другом. Кроме того, как уже отмечено, затравки остаются в составе вновь синтезированной ДНК, т. е. расходуются во время реакции.
Затем цикл смены температур повторяют. Во втором цикле происходят те же события, что и в первом, но кроме того используются в качестве матриц укороченные цепи, образовавшиеся в первом цикле: эти цепи еще раз укорачиваются (с З'-концов), и образуются цепи, содержащие только последовательность нуклеотидов искомого гена (см. рис. 4.24, цикл 2, цепь, выделенная штриховкой). В цикле 2 показаны превращения молекулы А, образовавшейся в цикле 1; аналогичным превращениям подвергается и молекула Б.
В следующем (третьем) цикле смены температур снова происходят те же события, что и в первых двух циклах, но кроме того используются в качестве матрицы цепи, содержащие только последовательность нуклеотидов искомого гена; в результате получается двухцепочечная молекула (выделена штриховкой), содержащая только ген данного белка.
Далее цикл смены температур повторяют многократно, и в каждом цикле (начиная с четвертого) происходит репликация гена, т. е. удвоение его количества в инкубационной смеси. Реакция протекает быстро, каждый трехстадийный цикл занимает около трех минут, за один час можно провести 20 циклов. Количество ДНК нарастает в геометрической прогрессии со множителем 2: за п циклов оно будет равно 2п; за 20 циклов увеличится примерно в миллион раз.
Поскольку матрица при матричном синтезе не расходуется, то исходная ДНК, внесенная в инкубационную смесь, в каждом цикле используется для синтеза укороченных с 5'-конца цепей (см. рис. 4.24, цикл 1). Количество этих матриц нарастает, однако не в геометрической, а в арифметической прогрессии, и через 20 циклов увеличивается примерно в 20 раз, что ничтожно мало по сравнению с миллионнократным увеличением количества гена.
Высокая эффективность ПЦР позволяет накопить необходимое количество ДНК при очень малых исходных количествах — достаточно одной капли крови, одного волоса, даже одной клетки или одной молекулы ДНК. Метод ПЦР резко ускорил изучение генома человека, и нашел практическое применение для диагностики болезней (ДНК-диагностика), а также для идентификации личности.
В частности, ПЦР применяют для диагностики инфекционных болезней. Традиционная диагностика таких болезней основана на использовании микробиологических методов, которые часто требуют гораздо больше времени и менее надежны, чем ДНК-диагностика. Метод основан на том, что первичная структура ДНК разных видов организмов различна. Следовательно, можно подобрать такие затравки, которые будут гибридизоваться с ДНК возбудителя, но не с ДНК человека. Если, используя эти затравки, провести ПЦР с материалом (кровь, биопсийный материал), полученным от больного, то нарастание количества ДНК в пробе будет указывать на наличие возбудителя в организме пациента: в ПЦР будет синтезироваться только ДНК возбудителя, а не пациента.
Вирусы, для которых характерен длительный латентный период (например, вирус иммунодефицита человека), трудно обнаружить на ранних стадиях развития инфекции. С помощью ПЦР это удается сделать даже тогда, когда вирус содержится лишь в незначительной части клеток организма.
Отличие вирусов от других организмов заключается в двух особенностях: 1) вирусная частица (вирион) содержит только один вид нуклеиновых кислот — или ДНК, или РНК; 2) вирионы отличаются необычной для живых существ простотой организации — они не имеют собственного метаболизма, не содержат клеточных орга-нелл, в том числе рибосом, и очень часто состоят только из нуклеиновой кислоты, заключенной в белковую оболочку. В связи с этим вирусы способны размножаться исключительно за счет использования метаболического аппарата другой клетки, т. е. они являются внутриклеточными паразитами.
Цикл размножения вируса начинается с его прикрепления к поверхности клетки. Вирион содержит специальные белки, узнающие определенные вещества мембраны клетки-хозяина; эти вещества называют рецепторами вируса. Например, бактериофаг Т4 прикрепляется только к клеткам Е. coli, полиовирус — к определенным клеткам человека, а также обезьян, вирус гриппа — к клеткам слизистой оболочки дыхательных путей. После прикрепления вирион проникает через мембрану внутрь клетки; иногда в клетку попадает только нуклеиновая кислота вириона. Затем с использованием аппарата клетки-хозяина начинается репликация вирусного генома и синтез вирусных белков; из них путем самосборки образуются новые вирионы, которые освобождаются из клетки, либо разрушая ее (лизис клеток), либо проходя через мембрану без разрушения клетки.
Многие вирусы в качестве генетического материала содержат ДНК, но есть группа вирусов, геном которых представлен рибонуклеиновой кислотой. Размеры генома вирусов невелики. Например, в ДНК бактериофага Т4 обнаружено 135 генов; из них 36 генов кодируют синтез разных белков, входящих в оболочку фага, а остальные — гены белков, обеспечивающих переключение аппарата клетки-хозяина на синтез компонентов вируса, а также гены белков, выполняющих вспомогательную роль при самосборке вирионов. Механизм репликации генома ДНК-содержащих вирусов принципиально не отличается от репликации ДНК других организмов. РНК-содержащие вирусы по механизму репликации генома делятся на две группы. В одну группу входят полиовирус, вирусы гриппа, бешенства, везикулярного стоматита, реовирусы, вирусы свинки, кори и др.
Прекращение матричных биосинтезов ведет к гибели клетки. На этом основано применение ингибиторов матричных биосинтезов для лечения инфекционных болезней и злокачественных опухолей. К таким ингибиторам, в частности, относятся многие антибиотики — вещества, выделяемые из микроорганизмов, главным образом из микроскопических грибов. Некоторые примеры указаны в табл. 4.4.
Антибиотики, взаимодействующие с ДНК, нарушают ее матричную функцию и подавляют репликацию или транскрипцию, или оба эти процесса. Их применяют для лечения опухолей. Противоопухолевые антибиотики практически одинаково взаимодействуют с ДНК, выделенной из любых клеток, как нормальных, так и опухолевых, т. е. они не отличаются избирательностью. Избирательность в их действии на клетки определяется не ДНК, а другими факторами, например различной проницаемостью клеточных мембран или особенностями метаболизма. Но эта избирательность не абсолютна, при лечении могут повреждаться и здоровые клетки, что требует осторожности при клиническом использовании противоопухолевых антибиотиков.
Антибиотики, взаимодействующие с белками рибосом, ингибируют трансляцию. Они применяются главным образом как противобактериальные средства, отличаются достаточно высокой избирательностью и часто сравнительно мало токсичны для человека. Это объясняется тем, что у бактерий рибосомы в целом, а также отдельные белки, входящие в состав рибосом, несколько отличаются по строению от рибосом и соответствующих белков эукариот.
С изменчивостью связаны такие важные для медицины явления, как гетерогенность популяций человека, существование наследственных болезней и предрасположенность к болезням.
Молекулярную основу изменчивости организмов составляют наследуемые изменения первичной структуры ДНК — мутации. Мутации возникают в результате ошибок синтеза ДНК в процессе репликации или при репарации повреждений ДНК, вызванных разного рода внешними факторами. Другой механизм изменчивости составляют рекомбинации — обмен участками ДНК между гомологичными хромосомами при половом размножении.
ПОВРЕЖДЕНИЯ И РЕПАРАЦИЯ ДНК
Ряд экзогенных факторов — УФ-, ионизирующие излучения, многие химические соединения — вызывают в ДНК разнообразные изменения. Например, для действия УФ-излучения характерно образование димеров тимидиловой кислоты (рис. 5.1).
Ионизирующие излучения вызывают разрывы нуклеотидных цепей и разнообразные изменения азотистых оснований. Этим объясняется летальное действие ионизирующей радиации. Многочисленные повреждения возникают при действии разных химических соединений — образование ковалентных связей между цепями ДНК, дезаминирование оснований, отщепление оснований и др.
Такие изменения могут происходить в живой клетке спонтанно, т. е. в результате локальных флюктуации тепловой энергии, а также под действием фонового излучения (в том числе космического) и некоторых веществ, попадающих в организм из среды. Наиболее часто при этом происходит гидролитическое отщепление пуриновых оснований (депуринизация ДНК). В результате депуринизации из ДНК диплоидных клеток человека за сутки теряется около 5«104 нуклеотидов. В пересчете на 70 лет жизни это означает утрату примерно 40 % всех пуриновых оснований организма. С меньшей скоростью (на 2-3 порядка) происходят дезаминирование цитозина и депиримидинизация.
В целом в каждой клетке человека за каждый день происходят тысячи повреждений ДНК. Очевидны фатальные последствия таких повреждений, если бы они не устранялись. В клетке существуют системы репарации ДНК — ферментные механизмы, которые обнаруживают и исправляют повреждения. В общих чертах репарация происходит следующим образом. Если повреждены азотистые основания (например, произошло их дезаминирование), то они обнаруживаются и удаляются ДНК-гликозидазами. Эти ферменты гидролитически расщепляют связь между поврежденным основанием и дезоксирибозным остатком, в результате чего на молекуле ДНК образуется апуриновый или апиримидиновый участок, т. е. пентозофосфатная цепь без азотистых оснований. Специфические эндонук-леазы узнают такие участки и гидролизуют в них 3',5'-фосфодиэфирную связь (рис. 5.2). Если депуринизация или депиримидинизация вызваны самим повреждающим агентом, то репарация начинается сразу с действия эндонуклеаз. Известно несколько систем репарации, устраняющих повреждения разного типа.