Первоначальные этапы истории биохимии совпадают с историей органической химии. До середины XIX в. органической химией называли науку, которая изучала вещества, входящие в состав животных и растительных организмов, т. е. вещества живого («органического») мира. Позднее, в связи с развитием синтетической химии соединений углерода, смысл термина «органическая химия» изменился — так теперь называют химию соединений углерода, а науку, изучающую химический состав живых организмов и химические процессы, протекающие в них, стали называть физиологической, а затем биологической химией. Биологическая химия изучает не только органические, но и неорганические (минеральные) соединения, содержащиеся в организмах. Разумеется, и после этой дифференциации органической и биологической химии их развитие происходит в тесном взаимодействии, объединяемое множеством общих методов и общих задач.
Историю биохимии (и органической химии) принято отсчитывать с конца XVIII в., когда впервые были выделены из организмов в чистом виде некоторые соединения — мочевина, лимонная кислота, яблочная кислота и др. В то время еще не было представлений о строении этих веществ. Длительный период развития биохимии, вплоть до середины XX в., заполнен открытием все новых веществ в живой природе, исследованием их структуры и химических превращений в организмах. Важнейшими достижениями этого периода явилось установление общего плана строения главных биополимеров — белков и нуклеиновых кислот, и раскрытие основных путей химических превращений веществ в организмах (метаболизм). В этот же период произошла дальнейшая дифференциация биохимии: в ней стали выделять статическую биохимию, изучающую химический состав организмов; динамическую биохимию, изучающую метаболизм; функциональную биохимию, изучающую связь химических процессов с физиологическими (биологическими) функциями.
Середина XX столетия явилась переломным этапом в истории биохимии. Развитие молекулярного уровня исследований в последующее время привело к перестройке структуры не только биохимии, но и всей биологии — ее методов, эмпирической основы, теоретических элементов, форм практического использования, классификации разделов биологии.
Отличительной чертой биохимии этого периода является переход к широкому изучению структуры и свойств индивидуальных представителей белков и нуклеиновых кислот, к выяснению функции каждого индивидуального белка и каждой функциональной единицы нуклеиновых кислот в живой клетке. Предпосылкой для этого послужило стремительное развитие методов разделения веществ и изучения их структуры, а также специфических для биохимии методов выделения и исследования надмолекулярных структур — клеточных органелл. Если в предшествующий период функциональная биохимия только зарождалась, то теперь она становится ведущим направлением в биохимии. По-прежнему сохраняются и усиливаются связи с органической химией, но одновременно резко возрастает значение связей биохимии с другими биологическими науками — цитологией, физиологией, генетикой. Наиболее ярким выражением этого явилось раскрытие молекулярных механизмов таких фундаментальных свойств жизни, как наследственность и изменчивость.
В 50-60-х годах XX в., когда была установлена структура ДНК, позволившая объяснить механизм репликации генов, возникло новое название для обозначения этого направления исследований — молекулярная биология. Первоначально молекулярной биологией называли область биохимии, изучающую молекулярные основы общебиологических явлений — наследственности, изменчивости, биологической эволюции. Однако очень скоро значение термина изменилось, и его стали применять в более широком смысле, вплоть до того, что некоторые биохимики считают термины «молекулярная биология» и «биохимия» синонимами.
До середины XX в. в биохимии преобладало исследование химических превращений веществ в организме, сопровождающихся изменением ковалентной структуры соединений (метаболизм). Однако со временем выяснилось, что не меньшее значение в обмене веществ и функционировании организма имеют физико-химические процессы, не связанные с изменением ковал ентной структуры соединений. Область биохимии, изучающую физико-химические и молекулярно-физичес-кие основы жизнедеятельности, называют физико-химической биологией.
Всякое изменение молекул в организме можно изучать в двух направлениях. Одно направление — выяснение роли этого процесса для функционирования живой клетки, органа, организма. В этом случае молекулярные процессы служат для объяснения биологических явлений. Другое направление — выяснение химических и физических основ этого процесса, т. е. объяснение поведения молекул в организме исходя из законов химической и физической форм движения материи. Исследования этого направления составляет содержание биоорганической химии. Биоорганическая химия занимает положение, пограничное с органической химией, в отличие от которой изучает прежде всего те свойства соединения, которые непосредственно связаны с его функцией в организме. Кроме того, биоорганическая химия, исходя из функций отдельных соединений в организме и механизма их действия, разрабатывает принципы создания синтетических биологически активных соединений, т. е. веществ, определенным образом изменяющих функции организма (лекарства, избирательно действующие инсектициды и др.).
Здесь названы основные направления биохимии, имеющие общебиологическое значение. Кроме того, в зависимости от конкретных объектов и задач исследования выделяют и другие разделы биохимии, например: биохимия вирусов, биохимия растений, биохимия животных.
Представление о белках как о классе соединений формировалось в XVIII-XIX вв. В этот период из разнообразных объектов живого мира (семена и соки растений, мышцы, хрусталик глаза, кровь, молоко и т. п.) были выделены вещества, обладающие сходными свойствами: они образовывали вязкие, клейкие растворы, свертывались при нагревании, при их высушивании получалась роговидная масса, при «анализе огнем» ощущался запах паленой шерсти или рога и выделялся аммиак. Поскольку все эти свойства ранее были известны для яичного белка, то новый класс веществ получил название белков.
В начале XIX в. появились более совершенные методы элементного анализа веществ и начались исследования элементного состава белков. В последних обнаружили углерод, водород, азот, кислород, серу и фосфор. Голландский химик и врач Г. Я. Мульдер (1802-1880) предложил первую теорию строения белков. Исходя из исследований элементного состава, Мульдер пришел к выводу, что все белки содержат одну или несколько групп (радикалов) C40H62N10O2, соединенных с серой или фосфором или с тем и другим вместе. Он предложил для обозначения этой группы термин «протеин» (от греч. протейон — первый), так как считал, что это вещество «без сомнения, важнейшее из всех известных тел органического царства, и без него, как кажется, не может быть жизни на нашей планете»*.
Представление о существовании такой группы скоро было опровергнуто, а значение термина «протеины» изменилось, и сейчас он применяется как синоним термина «белки».
Важную роль в изучении структуры белков сыграло развитие методов их разложения кислотами и пищеварительными соками. В 1820 г. А. Браконно (Франция) подвергал многочасовому действию серной кислоты кожу и другие ткани животных, затем нейтрализовал смесь, получал фильтрат, при выпаривании которого выпадали кристаллы вещества, названного им гликоколом («клеевым сахаром»). Это была первая аминокислота, выделенная из белков. Ее структурная формула установлена в 1846 г.К концу XIX в. из белков было выделено свыше десяти аминокислот. Исходя из результатов изучения продуктов гидролиза белков, немецкий химик Э. Фишер (1852-1919) предположил, что белки построены из аминокислот. Это положение послужило основанием для его многолетних исследований химии аминокислот и белков, завершившихся созданием в начале XX в. пептидной теории строения белков. В результате работ Э. Фишера стало ясно, что белки представляют собой линейные полимеры а-аминокислот, соединенных друг с другом амидной (пептидной) связью, а все многообразие представителей этого класса соединений могло быть объяснено различиями аминокислотного состава и порядка чередования разных аминокислот в цепи полимера. Однако эта точка зрения не сразу получила всеобщее признание: еще в течение трех десятилетий появлялись иные теории строения белков, в частности такие, которые основывались на представлении, что аминокислоты не являются структурными элементами белков, а образуются как вторичные продукты при разложении белков в присутствии кислот или щелочей.
Первые исследования белков проводились со сложными белковыми смесями, такими, как яичный белок, сыворотка крови, экстракты из растительных и животных тканей, а подчас и цельные ткани. Лишь в конце XIX в. получили распространение методы разделения белков с помощью осаждения нейтральными солями. В 30-е годы XX в. были получены первые белки в кристаллическом состоянии. Получение вещества в кристаллическом виде служит одним из надежных доказательств чистоты (гомогенности) препарата. В частности, в 1926 г. Д. Самнер выделил из семян канавалии белок (фермент) уреазу в кристаллическом состоянии; Д. Нортроп и М. Кунитц в 1930-1931 гг. получили кристаллы пепсина и трипсина. После этих пионерских работ выделение индивидуальных белков стало частым событием в истории биохимии, особенно после 50-х годов, когда начали применять современные методы фракционирования — хроматографию на гидрофильных ионообменниках, гель-фильтрацию («молекулярное просеивание»), новые методы электрофореза и др.
На современном этапе изучения белков основными направлениями являются следующие:
1) изучение пространственной структуры индивидуальных белков;
2) изучение механизмов функционирования индивидуальных белков (на уровне отдельных атомов и атомных групп молекулы белка);
3) изучение интегративной функции наборов белков, характерных для тех или иных субклеточных структур или типов клеток, а также для интегральных биохимических систем более высокого уровня, вплоть до целого организма и популяции организмов.
Основную роль в образовании третичной структуры играют нековалентные взаимодействия между радикалами аминокислот — водородные, ионные, гидрофобные связи. Аминокислоты, входящие в белки, различаются по физико-химическим свойствам радикалов. Между аминокислотами с неполярными (гидрофобными) радикалами возможны гидрофобные взаимодействия; между полярными радикалами возникают водородные связи, а между заряженными полярными радикалами — ионные (рис. 1.16). Все эти связи относятся к числу слабых: их энергия в водной среде не слишком сильно превышает энергию теплового движения молекул при комнатной температуре, и поэтому их образование и разрушение — легкообратимые процессы.В результате возникновения множества слабых связей между аминокислотными остатками все части пептидной цепи оказываются фиксированными относительно друг друга, образуя компактную структуру — глобулу. При этом а-спирали и (3-структуры располагаются преимущественно внутри глобулы, а (3-поворот и участки без периодической структуры — на поверхности глобулы.Значительная часть неполярных (гидрофобных) аминокислот оказывается погруженной во внутренние области глобулы, в то время как полярные (гидрофильные) аминокислоты располагаются преимущественно на поверхности глобулы, контактируя с водной фазой Такое распределение аминокислот объясняется в основном свойствами воды. Молекулы воды полярны и образуют водородные связи как между собой, так и с другими полярными молекулами (гидратация молекул). Неполярные молекулы не гидратируются. С другой стороны, внедрение неполярной молекулы в среду молекул воды требует разрыва водородных связей между молекулами воды. Поэтому возникают силы, стремящиеся уменьшить поверхность раздела между водной и неполярной фазой, что и приводит к объединению неполярных молекул между собой, а в случае белков — к «выжиманию» гидрофобных радикалов из водной среды внутрь глобулы.
Доля погруженных цистеиновых остатков тоже велика, хотя они и гидрофильны; это обусловлено тем, что многие из них участвуют в образовании дисульфидных связей.
При разрыве большого числа связей, стабилизирующих пространственную структуру белковой молекулы, упорядоченная, уникальная для каждого белка конформация пептидной цепи нарушается, и молекула целиком или в значительной части принимает форму случайного беспорядочного клубка (случайного в том смысле, что каждая молекула данного индивидуального белка по конформации может отличаться от всех других молекул).
Такое изменение белка называют денатурацией (рис. 1.20). Денатурацию можно вызвать нагреванием до 60-80 °С или действием других агентов, разрушающих нековалентные связи в белках. Денатурация происходит на поверхности раздела фаз, в кислых или, наоборот, щелочных средах, при действии ряда органических соединений — спиртов, фенолов и др.; часто для денатурации применяют мочевину или гуанидинхло-рид. Эти вещества образуют слабые связи (водородные, ионные, гидрофобные) с аминогруппами или карбонильными группами пептидного остова и с некоторыми группами радикалов аминокислот, подменяя собственные внутримолекулярные водородные связи в белке, вследствие чего вторичная и третичная структуры изменяются.Устойчивость к денатурирующим агентам в большой мере зависит от наличия дисульфидных связей в молекуле белка. В ингибиторе трипсина (панкреатический белок) есть три S — S-связи. Если их восстановить, то происходит денатурация без других денатурирующих воздействий. Если затем белок поместить в окислительные условия, в которых происходит окисление SH-групп цистеина и образование дисульфидных связей, то исходная конформация восстанавливается. Даже единственная дисульфидная связь существенно повышает стабильность пространственной структуры.
Денатурация обычно сопровождается снижением растворимости белка; при этом часто образуется осадок «свернувшегося белка», а если концентрация белков в растворе достаточно велика, то «свертывается» вся масса раствора, как это происходит при варке куриного яйца. При денатурации утрачивается биологическая активность белков. На этом основано применение водного раствора фенола (карболовая кислота) в качестве антисептика.
Лабильность пространственной структуры белков и большая вероятность их денатурации при разнообразных воздействиях создают значительные затруднения при выделении и изучении белков, а также при их использовании в медицине и промышленности.
В определенных условиях при медленном охлаждении раствора денатурированного нагреванием белка происходит ренативация — восстановление исходной (нативной) конформации (см. рис. 1.20, 4). Это подтверждает, что характер укладки пептидной цепи определяется первичной структурой белка. Процесс образования нативной конформации белка самопроизвольный, т. е. эта конформация отвечает минимуму свободной энергии молекулы. Можно сказать, что пространственная структура белка закодирована в аминокислотной последовательности пептидных цепей. Это означает, что все идентичные по чередованию аминокислот полипептиды (например, пептидные цепи миоглобина) будут принимать идентичную же конформацию. Однако из этого правила есть исключения. Капсид (оболочка) вируса кустистости томатов содержит белок, построенный из субъединиц А, В и С; первичная структура этих субъединиц идентична, а конформация различна. Известны идентичные олигопептидные последовательности (около 5 аминокислотных остатков), которые в одних белках образуют а-спирали, в других — р-структуры. Таким образом, нативная конформация каждого участка пептидной цепи зависит не только от его первичной структуры, но и от ближайшего окружения.
Белки, имеющие одинаковую или почти одинаковую конформацию, могут существенно различаться по первичной структуре. Например, миоглобин, а-прото-меры и [3-протомеры гемоглобина имеют почти одинаковую конформацию (см. рис. 1.9), но их первичная структура заметно различается: примерно в 70 % позиций аминокислоты не совпадают. Однако в таких случаях несовпадающие аминокислоты, как правило, сходны по физико-химическим свойствам боковых цепей.
Характерная структурная особенность фибриллярных белков — вытянутая, нитевидная форма молекул. Эти белки нерастворимы в воде и часто образуют многомолекулярные нитевидные комплексы — фибриллы.
Фибриллярный белок коллаген — самый распространенный белок в мире животных; в организме человека с массой тела 70 кг содержится от 12 до 15 кг белков, и половина этого количества приходится на коллаген. Молекула коллагена (тропоколлагена) построена из трех пептидных цепей, каждая из которых содержит около 1000 аминокислотных остатков. Необычен аминокислотный состав коллагена: каждая третья аминокислота — это глицин, 20 % составляют остатки пролина и гидроксипролина, 10 % — аланина, остальные 40 % представлены всеми другими аминокислотами. Коллаген — единственный белок, в котором содержится гидроксипролин. Эта аминокислота получается путем гидроксилирования части остатков пролина уже после образования пептидных цепей. Гидроксилиру-ется также некоторая часть остатков лизина с превращением в гидроксилизин.Каждая из пептидных цепей коллагена имеет конформацию спирали, отличающейся от а-спирали; в молекуле коллагена все'три спирали, в свою очередь, перевиты друг с другом, образуя плотный жгут (рис. 1.28). Между спиралями за счет пептидных групп образуются водородные связи (—C=0**«H—N—). Такие же водородные связи имеются и внутри каждой цепи.Молекулы коллагена, соединяясь «бок о бок», образуют микрофибриллы (см. рис. 1.28); из микрофибрилл формируются более толстые фибриллы, а из них — волокна и пучки волокон. Связи между молекулами коллагена в фибриллах ковалентные; они возникают за счет взаимодействия оксилизиновых остатков. В организме человека содержится не менее 19 разных типов коллагена. Коллагеновые волокна вместе с другими полимерными веществами межклеточного матрикса составляют основу соединительной ткани, обеспечивающую ее опорную функцию (гл. 18).
Эпидермис кожи, волосы, ногти содержат фибриллярные белки кератины. Пептидные цепи этих белков имеют конформацию а-спирали. В волосе три такие цепи, скрученные в суперспираль, образуют первичный агрегат (протофибриллу). Спиральный жгут из нескольких протофибрилл представляет собой микрофибриллу, жгут из микрофибрилл — макрофибриллу. В целом получается структура многожильного каната. В одном волосе содержатся сотни макрофибрилл, ориентированных по длине волоса. Молекулы кератина в макрофибрилле соединены друг с другом дисульфидными связями, что придает прочность и жесткость всей структуре.
Фибриллярные белки нерастворимы в воде. Они не перевариваются в пищеварительном тракте большинства животных и человека и поэтому не могут служить пищей (однако некоторые виды членистоногих, например моль и др., приспособились к питанию фибриллярными белками шерсти, кожи, перьев птиц).
Наиболее характерная черта, отличающая ферменты от других катализаторов — высокая специфичность их действия. Активный центр ферментов, как и других белков, образован боковыми группами аминокислотных остатков пептидной цепи. Строение активных центров ферментов, катализирующих разные реакции, различно. Структура активного центра фермента комплементарна структуре его субстрата, вследствие чего данный фермент из множества веществ, имеющихся в живой клетке, присоединяет только свой субстрат. Эту особенность называют субстратной специфичностью фермента. Например, структура активного центра фермента гистидазы комплементарна структуре аминокислоты гистидина, поэтому возможно образование фермент-субстратного комплекса гистидаза—гистидин; другие вещества, в том числе аминокислоты, не связываются гистидазой.
Кроме того, часть функциональных групп активного центра ферментов имеет такое строение и реакционную способность, что обеспечивается химическое превращение субстрата в новые вещества — продукты ферментативной реакции. Каждый фермент катализирует не любое из всех возможных химических превращений субстрата, а какое-либо одно. Назовем это свойство специфичностью пути превращения.Жиры — это группа соединений, отдельные представители которых различаются природой жирно-кислотных остатков (радикалов R). Липаза расщепляет жиры, включающие разные жирно-кислотные остатки. Другой пример групповой специфичности — действие ферментов, гидролизующих пептиды и белки: многие из этих ферментов расщепляют пептидные связи, образованные разными аминокислотами.
Пространственная структура стереоизомеров вещества различна, поэтому активный центр фермента, комплементарный одному стереоизомеру, не обязательно будет комплементарен и другим стереоизомерам. В связи с этим многие ферменты катализируют превращение лишь одного из стереоизомеров — стереоспецифич-ность. Например, малеиновая кислота, являющаяся г^оизомером фумаровой кислоты (рис. 2.3), не может быть субстратом фумаразы.
Реакции трансаминирования проходят в две стадии (полуреакции). Если к раствору фермента добавить только один из двух субстратов — аланин, то произойдет первая полуреакция (рис. 2.8). Аминогруппа аланина присоединяется к углероду альдиминной группы фермента: альдиминная связь между кофермен-том и белком заменяется на альдиминную связь между коферментом и аланином. Далее происходит внутримолекулярная перестройка в области альдиминной связи (см. рис. 2.8) и затем гидролиз с образованием аминогруппы на коферменте и кетогруппы на бывшей аминокислоте (теперь это уже сх-кетокислота). В целом в результате этой полуреакции пиридоксальфосфат (точнее, пиридоксальдимин фосфат) превращается в пиридоксаминфосфат, а аланин — в пировиноградную кислоту:Конечно, в этом процессе участвуют и функциональные группы белковой части фермента, а не только кофермент. Субстратная специфичность разных аминот-рансфераз определяется исключительно белковой частью, поскольку кофермент во всех случаях один и тот же. Специфичность пути превращения также зависит от белковой части, поскольку пиридоксальфосфат функционирует в качестве ко-фермента не только в реакциях трансаминирования, но и в некоторых реакциях других типов (изомеризация, декарбоксилирование, дегидратация).
В реакциях, катализируемых этими ферментами, в качестве кофермента участвует никотинамидадениндинуклеотид (НАД). Две половины молекулы НАД,объединенные связью между остатками фосфорной кислоты, построены по одинаковому плану (рис. 2.9). Одна половина представляет собой остаток нуклеотида (адениловой кислоты). Другая половина тоже нуклеотид; его азотсодержащая гетероциклическая группа представлена амидом никотиновой кислоты. Никотиновая кислота — это витамин PP.НАД-зависимые дегидрогеназы катализируют реакции окисления веществ путем дегидрирования; при этом окисляемое вещество служит донором водорода (ДН2), а НАД выполняет роль акцептора водорода, т. е. восстанавливается. Остаток никотинамида в молекуле НАД принимает непосредственное участие в реакции Отметим, что из двух атомов водорода (2 протона + 2 электрона), отщепляемых от субстрата, к НАД присоединяются один протон (второй переходит в среду) и два электрона, в результате чего утрачивается положительный заряд пиридинового цикла НАД.
Молекула кофермента А построена из аденозин-3'-фосфат-5'-пирофосфата, соединенного сложноэфирной связью с пантотеновой кислотой, которая, в свою очередь, соединена амидной связью с р-меркаптоэтиламином (тиоэтанолами-ном) — см. рис. 2.15.
Пантотеновая кислота является витамином. Кофермент А участвует во множестве превращений карбоновых кислот в живой клетке. Карбоновые кислоты присоединяются своей карбоксильной группой к SH-группе кофермента А, образуя тиоэфирную связь. Эта связь имеет высокоэнергетический характер. В уравнениях реакций кофермент изображают символом HS-KoA, а ацильные производные — ацил-S-KoA или просто ацил-КоА (ацетил-КоА, пальмитил-КоА, сукцинил-КоА и т. п.).В этой реакции АТФ используется в качестве источника энергии при образовании высокоэнергетической тиоэфирной связи в ацил-КоА. Ацильный остаток в составе ацил-КоА может подвергаться многообразным превращениям или может быть перенесен без изменений на другое вещество. Реакции переноса катализируются ферментами группы ацилтрансфераз.Из рассмотренных примеров видно, что каждый из коферментов может существовать в двух формах, циклически превращающихся друг в друга: ФАД и ФАД*Н2, КоА и ацил-КоА, и т. д. Некоторые коферменты можно рассматривать как часть активного центра фермента, например пиридоксальфосфат, ФАД, ФМН. Другие же участвуют в ферментативных реакциях скорее как субстраты (регенерирующиеся субстраты) — НАД, КоА; в этом случае превращение кофермента из одной формы в другую может происходить в результате действия двух разных ферментов. Например, превращение КоА в ацил-КоА катализирует ацил-КоА-синтетаза, а регенерация КоА происходит при действии ацилтрансферазы.
Ингибиторами ферментов называют вещества, снижающие их активность. Наибольший интерес представляют ингибиторы, взаимодействующие с активным центром фермента. Такие ингибиторы чаще всего являются структурными аналогами субстрата и, следовательно, комплементарны активному центру фермента. Поэтому они подавляют активность только одного фермента или группы ферментов с очень сходным устройством активного центра. Различают ингибиторы конкурентные и неконкурентные, обратимые и необратимые.
Малоновая кислота НООС—СН2—СООН является структурным аналогом янтарной кислоты, поэтому она может присоединяться к активному центру сукци-натдегидрогеназы (см. выше). Но дегидрирование малоновой кислоты невозможно. Если в реакционной смеси имеются одновременно и янтарная, и малоновая кислоты, то происходят следующие процессы:Некоторые молекулы фермента оказываются занятыми ингибитором (I) и не участвуют в реакции превращения субстрата: следовательно, скорость образования продукта снижается. Если повышать концентрацию субстрата, то доля комплекса ES увеличивается, а комплекса EI уменьшается: субстрат и ингибитор конкурируют за активный центр фермента. Это пример конкурентного ингибирования. При достаточно высокой концентрации субстрата весь фермент будет в форме комплекса ES и скорость реакции будет максимальной, несмотря на присутствие ингибитора.
Некоторые ингибиторы образуют комплекс не со свободным ферментом, а с фермент-субстратным комплексом:В этом случае повышение концентрации субстрата не уменьшает действие ингибитора; такие ингибиторы называются неконкурентными.
В некоторых случаях ингибитор может подвергаться химическому превращению под действием фермента. Например, тг-нитрофени л ацетат гидролизуется протеолитическим ферментом химотрипсином; гидролиз происходит в две стадии.