Как мы видели, репликация служит для передачи информации новым поколениям. С другой стороны, информация, записанная в ДНК (в генотипе), обеспечивает образование фенотипических признаков организма, трансформируется в фенотип. Это направление потока информации имеет гораздо более сложную природу и включает два других типа матричных биосинтезов — транскрипцию и трансляцию.
Классическая генетика пользуется такими фенотипическими признаками, как окраска цветка, форма крыльев у дрозофилы, длина шерсти у овец и т. п. Такие признаки не позволяют анализировать механизм трансформации генотипа в фенотип в терминах молекулярных процессов. Но вот в 1902 г. английский врач Гар-род опубликовал исследования по алкаптонурии у человека. Для этой болезни характерно выделение с мочой значительных количеств гомогентизиновой кислоты, которая, окисляясь кислородом воздуха, образует черный пигмент. Болезнь врожденная, и ее обычно обнаруживают по появлению черных пятен на пеленках.
Гаррод установил, что алкаптонурия наследуется как рецессивный единичный, не сцепленный с другими признак. Отсюда следовал вывод, что гены контролируют простые биохимические реакции. Значительно позднее (1958 г.) выяснилась причина накопления гомогентизиновой кислоты: это вещество оказалось промежуточным продуктом распада тирозина Гомогентизиновая кислота у здоровых людей превращается в фумарилацетоук-сусную кислоту при действии оксидазы гомогентизиновой кислоты. У больных алкаптонурией этот фермент отсутствует или его активность очень низка, поэтому превращения тирозина останавливаются на этой стадии. Теперь можно было заключить, что гены контролируют синтез ферментов, и связь между геном и фе-нотипическим признаком представить следующим образом:Некоторые продукты реакции проявляются как непосредственно видимые фенотипические признаки классического типа, например пигмент цветка. Однако первым продуктом гена может быть не обязательно фермент, а любой белок, свойства которого определяют тот или иной фенотипический признак. Например, от зрительного пурпура (родопсина) сетчатки глаза зависит способность воспринимать свет, от синтеза фибриллярных белков кератинов зависит образование шерсти или рогового покрова, и т. д.
В 40-50-е годы XX в. это представление о связи между генотипом и фенотипом было экспериментально подтверждено на многих ферментах и других белках разных организмов; результаты нашли отражение в афористической формуле: один ген — один белок.
Но каким образом гены контролируют синтез белков? Можно представить два механизма: а) ген просто включает и выключает синтез белка; б) ген содержит инструкцию о строении белка.
В решении этого вопроса помогло исследование другой наследственной болезни человека — серповидно-клеточной анемии. Л. Полинг (США) в 1949 г. обнаружил, что гемоглобин таких больных отличается от гемоглобина здоровых людей по электрофоретической подвижности. Как стало ясно позднее, это различие обусловлено заменой 6Glu -* Val в р-цепи гемоглобина. Отсюда следовал вывод, что ген определяет первичную структуру белков. При этом информация, записанная с помощью определенного чередования нуклеотидных остатков, переводится в информацию, записанную чередованием аминокислотных остатков. Это можно сравнить с переводом записи, сделанной азбукой Морзе, на буквенную запись.
ДНК в клетках эукариот сосредоточена главным образом в ядре, а синтез белков обнаруживается и в частях клетки, не содержащих ДНК. Роль промежуточного переносчика информации от ДНК к местам синтеза белка выполняют рибонуклеиновые кислоты. Направление потока информации в клетке от генотипа к фенотипу представляют так: ДНК -* РНК -* белки. Иначе говоря, ДНК служит матрицей для синтеза РНК, а РНК — матрицей для синтеза белков (см. рис. 4.1). Это положение называют основным постулатом молекулярной биологии.
Биосинтез белков (трансляция) отличается от других типов матричных биосинтезов — репликации и транскрипции — двумя принципиальными особенностями:
1) нет соответствия между числом знаков (мономеров) в матрице и в продукте реакции (в мРНК 4 разных нуклеотида, в белке 20 разных аминокислот);
2) структура рибонуклеотидов (мономеров матрицы) и аминокислот (мономеров продукта) такова, что избирательные взаимодействия между ними, подобные образованию пар А«««Т или G«««C, невозможны; иначе говоря, между мРНК (матрицей) и пептидной цепью белка (продуктом) нет комплементар-ности.
Из этого следует, что механизм использования матрицы при биосинтезе белков должен быть иным, чем в случае синтеза ДНК или РНК. Если репликацию и транскрипцию можно сравнить просто с переписыванием текста, то трансляция — это дешифровка, декодирование информации об аминокислотной последовательности, записанной (закодированной) с помощью нуклеотидной последовательности. Способ шифровки в нуклеиновых кислотах информации о первичной структуре белков получил название биологического кода (его называют также генетическим, нуклеотидным, аминокислотным кодом).Один из первых вопросов, который возникает при выяснении структуры биологического кода, это вопрос о кодовом числе, т. е. о числе нуклеотидных остатков, кодирующих включение в белок одной аминокислоты. Очевидно, что кодовое число не может быть равным 1, так как в этом случае с помощью четырех нуклеотидов можно было бы закодировать только четыре аминокислоты. При кодовом числе 2 количество разных нуклеотидных пар будет равно числу перестановок из четырех элементов по 2, т. е. равно 42 = 16, что тоже недостаточно для кодирования всех аминокислот. Число разных троек нуклеотидов равно 43 = 64. Это в три с лишним раза превышает минимальное число, необходимое для кодирования 20 аминокислот. Экспериментально доказано, что в биологическом коде кодовое число равно 3: тройку нуклеотидных остатков (триплет), кодирующих включение одной аминокислоты, называют кодоном.Для выяснения смысла кодонов, т. е. вопроса, какой аминокислоте соответствует каждый из кодонов, были использованы бесклеточные системы синтеза белков. В такой системе матрицей могут служить синтетические рибонуклеиновые кислоты с известной нуклеотидной последовательностью, например поли(и).
Между аминокислотами и нуклеотидами (или триплетами нуклеотидов) невозможны специфические, комплементарные взаимодействия по типу образования нуклеотидных пар А»»»Т (или A*«»U) и G»»»C. Поэтому было сделано предположение о существовании молекул-адапторов, каждая из которых может взаимодействовать с определенным кодоном — с одной стороны, и с определенной аминокислотой — с другой стороны. В 1957 г. такие молекулы обнаружены, ими оказались транспортные РНК (тРНК). Очевидно, что для адаптирования 20 разных аминокислот нужно не менее 20 разных тРНК: для каждой аминокислоты своя.Аминоацил-тРНК-синтетазы. Взаимодействие тРНК с аминокислотами — ферментативный процесс, приводящий к образованию ковалентной связи между аминокислотой и тРНК. Такие соединения называют аминоацил-тРНК (аа-тРНК). Аминокислота присоединяется к З'-концу нуклеотидной цепи тРНК, где имеется последовательность А—С—С—, общая для всех тРНК; при этом образуется сложноэфирная связь за счет карбоксильной группы аминокислоты и З'-гидроксильной группы концевого остатка адениловой кислоты в тРНК (рис. 4.14).
Эта связь имеет высокоэнергетический характер, так что образование аа-тРНК можно рассматривать как активацию аминокислоты. Реакции аминокислот с тРНК нуждаются в энергии (используется АТФ) и катализируются аминоа-цил-тРНК-синтетазами:
Отличие вирусов от других организмов заключается в двух особенностях: 1) вирусная частица (вирион) содержит только один вид нуклеиновых кислот — или ДНК, или РНК; 2) вирионы отличаются необычной для живых существ простотой организации — они не имеют собственного метаболизма, не содержат клеточных орга-нелл, в том числе рибосом, и очень часто состоят только из нуклеиновой кислоты, заключенной в белковую оболочку. В связи с этим вирусы способны размножаться исключительно за счет использования метаболического аппарата другой клетки, т. е. они являются внутриклеточными паразитами.
Цикл размножения вируса начинается с его прикрепления к поверхности клетки. Вирион содержит специальные белки, узнающие определенные вещества мембраны клетки-хозяина; эти вещества называют рецепторами вируса. Например, бактериофаг Т4 прикрепляется только к клеткам Е. coli, полиовирус — к определенным клеткам человека, а также обезьян, вирус гриппа — к клеткам слизистой оболочки дыхательных путей. После прикрепления вирион проникает через мембрану внутрь клетки; иногда в клетку попадает только нуклеиновая кислота вириона. Затем с использованием аппарата клетки-хозяина начинается репликация вирусного генома и синтез вирусных белков; из них путем самосборки образуются новые вирионы, которые освобождаются из клетки, либо разрушая ее (лизис клеток), либо проходя через мембрану без разрушения клетки.
Многие вирусы в качестве генетического материала содержат ДНК, но есть группа вирусов, геном которых представлен рибонуклеиновой кислотой. Размеры генома вирусов невелики. Например, в ДНК бактериофага Т4 обнаружено 135 генов; из них 36 генов кодируют синтез разных белков, входящих в оболочку фага, а остальные — гены белков, обеспечивающих переключение аппарата клетки-хозяина на синтез компонентов вируса, а также гены белков, выполняющих вспомогательную роль при самосборке вирионов. Механизм репликации генома ДНК-содержащих вирусов принципиально не отличается от репликации ДНК других организмов. РНК-содержащие вирусы по механизму репликации генома делятся на две группы. В одну группу входят полиовирус, вирусы гриппа, бешенства, везикулярного стоматита, реовирусы, вирусы свинки, кори и др.
Введение витамина В12 быстро излечивает злокачественную анемию. Однако при этом выяснилось, что имеет значение способ введения: внутримышечные инъекции излечивают анемию, а прием витамина через рот не излечивает. Если же витамин В12 принимать перорально вместе с желудочным соком, тоже наступает излечение. Отсюда следует, что в желудочном соке содержится какое-то вещество, необходимое для усвоения витамина В12 при его введении через рот. Это вещество (внутренний фактор, фактор Касла) сейчас выделено: им оказался гли-копротеин, который у здоровых людей синтезируется в клетках желудка и секре-тируется в желудочный сок. Внутренний фактор избирательно связывает витамин В12 (одна молекула витамина на одну молекулу белка); затем, уже в кишечнике, этот комплекс присоединяется к специфическим рецепторам мембраны энтероцитов, и происходит перенос витамина через их мембрану, т. е. всасывание.
Злокачественная анемия обычно развивается как осложнение гастрита, причем таких его форм, при которых резко снижается образование желудочного сока. Отсюда такие симптомы, как боли в области желудка, отсутствие аппетита. В желудке при этом нет внутреннего фактора и, следовательно, невозможно всасывание витамина В12: витамин, содержащийся в пище, выводится с калом. Развитие анемии — это уже следствие недостатка витамина В12 в тканях.
Витамин В12 выполняет коферментные функции. В организме человека есть две коферментные формы витамина В12 (кобаламина): метилкобаламин — в цитоплазме и дезоксиаденозилкобаламин — в митохондриях. В метилкобаламине вместо аденозильной группы, связанной с атомом кобальта (см. рис. 6.1), имеется метальная группа. В развитии анемии основная роль принадлежит дефициту ме-тилкобаламина, который служит коферментом в реакциях трансметилирования (подробнее об этих реакциях см. в гл. 11). Реакции траснметилирования происходят, в частности, при синтезе нуклеотидов и нуклеиновых кислот. Поэтому при недостатке метилкобаламина синтез нуклеиновых кислот нарушается. Это проявляется прежде всего в тканях с интенсивной клеточной пролиферацией. К их числу относится и кроветворная ткань. Деление и созревание клеток эритроци-тарного ряда нарушаются, размеры клеток превышают нормальные, значительная часть клеток — предшественников эритроцитов разрушается еще в костном мозге. В циркулирующей крови количество эритроцитов резко уменьшено, размеры их увеличены. При отсутствии лечения наступают изменения и в других тканях, и болезнь заканчивается гибелью больного. Введение 100-200 мкг витамина В12 ежедневно в течение примерно двух недель излечивает болезнь.
Другая коферментная форма витамина В12 — дезоксиаденозилкобаламин, участвует в метаболизме метилмалоновой кислоты, которая получается в организме из жирных кислот с нечетным числом углеродных атомов, а также из аминокислот с разветвленной углеродной цепью (подробнее об этом см. в гл. 10). При дефиците витамина В12 метилмалоновая кислота накапливается в организме и в больших количествах выводится с мочой; ее определение в моче используется для диагностики злокачественной анемии.
Метилмалоновая кислота токсична для нервной ткани и при отсутствии лечения вызывает дегенерацию заднебоковых столбов спинного мозга.
Единственным источником витамина В12 в природе являются микроорганизмы, синтезирующие его из других веществ; через почву он попадает в растения, а с растениями — в организмы животных. Для человека основным источником витамина В12 служит животная пища. Наиболее богата витамином печень — около 100 мкг на 100 г печени; в говяжьем мясе содержится около 5 мкг витамина на 100 г мяса. Суточная потребность человека в этом витамине составляет 2,5-5 мкг.Большинство витаминов входит в состав коферментов, и именно по этой причине они необходимы организму. Витамин А служит кофактором белка неферментной природы — родопсина, или зрительного пурпура; этот белок сетчатки глаза участвует в восприятии света. Витамин D (точнее, его производное — кальцитри-ол) регулирует обмен кальция; по механизму действия он сходен с гормонами — регуляторами обмена и функций организма. Витамин Е (токоферол) выполняет роль антиоксиданта. Подробнее функции каждого из витаминов рассматриваются в других разделах.
Некоторые сигнальные молекулы — стероидные гормоны, витамин D, ретиноевая кислота, тироксин — обладают липофильными свойствами и легко проходят через клеточные мембраны. Рецепторы этих веществ находятся в цитозоле или в ядре клетки; соответственно, комплекс гормона с рецептором может образоваться непосредственно в ядре или образуется в цитозоле, а затем поступает в ядро (рис. 7.21). Комплекс гормон—рецептор связывается с определенной нуклеотидной последовательностью в области энхансера или сайленсера определенного гена. При связывании с энхансером стимулируется транскрипция гена (увеличивается частота инициации транскрипции): количество белка, кодируемого этим геном, в клетке увеличивается. При связывании комплекса гормон—рецептор в области сайленсера эффект будет противоположным.Эндоцитоз — очень распространенная функция клеток, заключающаяся в переносе веществ из среды в клетку вместе с частью плазматической мембраны, путем образования мембраной пузырьков. Таким путем в клетку вводятся как растворенные вещества (вместе с капелькой растворителя — пиноцитоз), так и нерастворимые вещества (частицы) — фагоцитоз. Большинство клеток (если не все) способны к эндоцитозу. Особенно активны в этом отношении лейкоциты, макрофаги, клетки эндотелия капилляров.
Образование эндоцитозного пузырька (рис. 7.22) может начаться без каких либо внешних сигналов: многие клетки образуют эндоцитозные пузырьки ритмично, с постоянной частотой, поглощая внеклеточную жидкость и содержащиеся в ней частицы. В других случаях эндоцитоз индуцируется при контакте мембраны с определенными веществами. Для многих веществ, являющихся нормальными компонентами организма, в мембране имеются специфические рецепторы, улавливающие из крови или межклеточной жидкости комплементарные им лиганды; присоединение лиганда к рецептору индуцирует эндоцитоз. Например, рецепторы плазматической мембраны гепатоцитов улавливают многие гликопротеины плазмы крови, а затем эти белки эндоцитируются.
Человек, как и все гетеротрофные организмы, получает энергию за счет разложения органических веществ пищи. Органические вещества в условиях поверхности Земли являются термодинамически нестабильными: они самопроизвольно (необратимо) распадаются. Самопроизвольные процессы — это экзергоничес-кие процессы, т. е. они сопровождаются уменьшением свободной энергии (-AG), и поэтому могут служить источниками энергии для функционирования живой клетки. В результате самопроизвольного распада в конечном счете образуются термодинамически стабильные продукты. Такими конечными продуктами распада пищевых веществ в организме человека являются диоксид углерода и вода. Еще один из основных конечных продуктов обмена — это мочевина. Она не относится к числу термодинамически стабильных веществ; образование мочевины связано с энергетическим обменом лишь косвенно и служит для выведения избытка азота из организма, поэтому синтез мочевины подробнее рассматривается в связи с обменом аминокислот в гл. 11.
Термодинамически нестабильные вещества могут быть достаточно стабильными кинетически. Например, глюкоза вне организма может сохраняться столетиями, в то время как в организме человека ежесуточно распадается примерно 0,5 кг глюкозы. Кинетическая стабильность в живой клетке преодолевается в результате ферментативного катализа. Основными веществами, за счет которых организм человека обеспечивается энергией, служат углеводы и жиры пищи (табл. 8.1). Меньшее значение имеют белки, однако при преимущественно белковом питании и при голодании их роль значительно возрастает.В углеводах, жирах и белках (аминокислотах) содержание кислорода меньше, чем в конечных продуктах их распада. Иначе говоря, катаболизм этих веществ связан с потреблением кислорода и реакциями окисления. В этом и состоит сущность дыхания, впервые объясненная Лавуазье.
Первую реакцию процесса катализирует пируватдекарбоксилаза (Е1, рис. 8.8). Субстратами этого фермента служат пируват и дигидролипоевая кислота, которая
является простетической группой второго фермента — дигидролипоат-ацетилтранс-феразы (Е2).
Липоевая кислота (рис. 8.9) содержит дисульфидную группу в составе пятичлен-ного гетероцикла и боковую цепь; своей карбоксильной группой липоевая кислота соединена амидной связью с е-аминогруи-пой остатка лизина, входящего в пептидную цепь ацетилтрансферазы.
В результате действия пируватдекар-боксилазы (Е1) от пировиноградной кислоты отщепляется карбоксильная группа, а ацетильный остаток присоединяется к атому серы липоевой кислоты, т. е. получается ацетиллипоат-Е2.
Пируватдекарбоксилаза — сложный белок: он содержит тиаминдифосфат, выполняющий роль кофермента (рис. 8.10). Тиаминдифосфат — это производное витамина В2 (тиамина) и пирофосфорной кислоты. Декарбоксилирование пирувата происходит при прямом участии тиаминди-фосфата: в ходе реакции к атому углерода тиазолового кольца (на рис. 8.10 помечен звездочкой) присоединяется промежуточный продукт превращения пирувата — оксиэтильный остаток СН3—СНОН—, который затем переносится на липоевую кислоту, превращаясь при этом в ацетильный остаток СН3—СО—.
Второй фермент комплекса — дигидролипоат-ацетилтрансфераза — катализирует перенос ацетильного остатка, соединенного с его (фермента 2) собственной простетической группой, на КоА; при этом получаются дигидролипоевая кислота (в составе ацетилтрансферазы) и ацетил-КоА.
Третий фермент — дегидрогеназа дигидролипоевой кислоты (ЕЗ). Акцептором водорода в реакции служит НАД. В результате дегидрирования дигидролипоевая кислота превращается в начальную форму — дегидролипоевую кислоту, и пируватдегидрогеназный комплекс может реагировать с очередной молекулой пирувата. Дигидролипоилдегидрогеназа содержит в качестве кофермента ФАД, который служит промежуточным акцептором водорода.
Таким образом, в окислительном декарбоксилировании пирувата участвует пять коферментов. Три из них — тиаминпирофосфат, липоевая кислота и ФАД — прочно связаны с ферментами комплекса, а два других — КоА и НАД — находятся в свободно растворенном состоянии и служат акцепторами главных конечных продуктов — ацетильного остатка и атомов водорода. Ацетильный остаток затем окисляется в цитратном цикле, а водород с НАДН поступает в цепь переноса электронов и протонов.
Пируватдегидрогеназный комплекс представляет собой крупную частицу с молекулярной массой 7-10 млн. В его состав входит примерно по три десятка молекул Е1 и Е2 и около десятка молекул ЕЗ. Отдельные ферменты соединены друг с другом таким образом, что серосодержащая часть липоевой кислоты, соединенная с Е2 достаточно длинной и гибкой углеводородной цепью, может «наносить визиты» последовательно активному центру Е1, своему собственному активному центру и активному центру ЕЗ.
Общий путь катаболизма — это прежде всего путь поставки водорода органических веществ в дыхательную цепь.В живой клетке энергия, заключенная в пирувате, извлекается иным путем — с участием реакций дегидрирования: всего в общем пути катаболизма происходит пять реакций дегидрирования, в которых участвует 10 атомов водорода. Но пиро-виноградная кислота содержит только 4 атома водорода, т. е. только на две реакции дегидрирования. Еще б атомов водорода поступает из двух молекул воды, потребляемых в реакциях цитратного цикла (реакции 1 и 9 на рис. 8.12), и из одной-молекулы воды, которая получается в реакции 7 при превращении ГДФ и Н3Р04 в ГТФ. Следовательно, водород трех молекул воды (в расчете на 1 молекулу пирувата) включается в метаболиты цитратного цикла и в конечном счете попадает в гидрированные коферменты — НАДН или QH2.Для непрерывного протекания реакций общего пути катаболизма кофермен-ты, перешедшие в восстановленное состояние, должны снова окислиться. Их окисление происходит путем переноса водорода с коферментов на атмосферный кислород в митохондриальной дыхательной цепи (см. рис. 8.1). Таким образом, общий путь катаболизма и дыхательная цепь представляют собой единый процесс, и эти две его части не могут функционировать отдельно одна от другой.
Энергия переноса водорода с дегидрируемых субстратов общего пути катаболизма на атмосферный кислород используется для синтеза АТФ. При переносе водорода с каждой молекулы НАДН в дыхательной цепи образуется 3 молекулы АТФ. В четырех реакциях дегидрирования в общем пути катаболизма образуется 4 НАДН; следовательно, синтезируется 4x3= 12 молекул АТФ. В одной реакции (катализируемой сукцинатдегидрогеназой) водород переносится на убихинон; при дальнейшем переносе в дыхательной цепи в этом случае синтезируется 2 молекулы АТФ. И, наконец, в цитратном цикле происходит одна реакция субстратного фосфорилирования, дающая еще одну молекулу АТФ. Таким образом всего при распаде 1 моль пирувата образуется 15 моль АТФ. Отметим, что 3 из них образуются при окислительном декарбоксилировании пирувата и 12 — в цитратном цикле. Эти величины отражают теоретически возможный максимум синтеза АТФ; фактически АТФ синтезируется меньше, поскольку часть электрохимического потенциала расходуется на перенос разных веществ через мембрану при участии транслоказ.