Цель курса биохимии — научить будущих врачей применять при изучении последующих дисциплин и в профессиональной врачебной деятельности сведения о химическом составе и молекулярных процессах организма как о характеристиках нормы и признаках патологии. Исходя из этого, в предлагаемом издании особое внимание уделяется сведениям о непосредственной связи молекулярных процессов с физиологическими (биологическими) функциями клетки и организма. Например, с этой точки зрения один из центральных вопросов общей биохимии — о механизмах ферментативного катализа — представляется нам менее важным, чем вопрос о субстратной специфичности и многообразии ферментов в организме.
Сведения о молекулярных механизмах патогенеза болезней, имеющиеся в каждой главе, выполняют не только информативную, но и мотивационную роль, поскольку подчеркивают значение биохимии для изучения клинических дисциплин и для будущей профессиональной деятельности. Вместе с тем биохимия должна сохранять характер фундаментальной дисциплины, составляя вместе с другими медико-биологическими дисциплинами теоретическую основу медицины.
Как используется знание медико-биологических дисциплин в практической деятельности врача? Установление диагноза болезни и назначение адекватного лечения включают ряд мыслительных операций, начиная с отбора симптомов из многих тысяч диагностических признаков, известных современной медицине. Отобранные симптомы складываются в клиническую картину, на основе которой делают заключение о сущности болезни и, наконец, устанавливают диагноз страдания конкретного больного, служащий базой для определения методов лечения. При этом мысль врача постоянно возвращается от последующего этапа к предыдущему и корректируется путем сопоставления промежуточных заключений. Центральную роль в этом процессе играют образы сущности болезней, имеющиеся в памяти врача. Они служат главным ориентиром и в движении к диагнозу, и в движении от диагноза к способам лечения. А сущности болезней, равно как мишени и механизмы действия лекарств и лечебных мероприятий, описываются в терминах и понятиях морфологии, физиологии и биохимии. При этом клиницисту требуется интегральное описание морфологии, физиологии и биохимии патологических состояний: нет такой функции и нет такой болезни, которые можно было бы описать в рамках одной или двух из этих дисциплин.
При составлении книги мы стремились подбирать такие факты, конкретные явления, частные приложения биохимии, на основе которых проще перейти к обобщениям, чтобы, исходя из них, можно было понимать и конструировать другие конкретные явления того же класса, составляющие содержание биохимии. Такой подход позволяет решить и проблему, связанную со старением информации. Современный врач вынужден не только знать тонкости своего дела, но и уметь ориентироваться в быстро меняющейся информационной обстановке. Знание основных концепций, закономерностей и методов биохимии помогает студенту (врачу) находить и понимать новую информацию по биохимии и применять ее для решения медицинских проблем.
При написании книги мы исходили из того, что будущие врачи, начинающие изучать биохимию, имеют запас знаний о молекулах и молекулярных процессах, полученный в средней школе и в курсах химических дисциплин, предшествующих или параллельных курсу биохимии. Поэтому мы в ряде случаев нарушали логику изложения химизма биохимических процессов, чтобы сохранить логику изложения их биологического смысла и значения.
Для читателя важно помнить, что в каждом очередном разделе содержится больше информации, чем можно извлечь при первом чтении, основываясь на знании только предшествующих разделов. Это обычная ситуация при описании сложных кооперативных систем, в которых все части образуют единое функциональное целое. Именно к таким системам относятся объекты биологии, в том числе биохимия человека.
Настоящее издание отражает результат многолетней эволюции преподавания биохимии в ММА. При подготовке нового издания учтены многочисленные и существенные изменения содержания биохимии за последние годы. В соответствии с этим внесены значительные изменения и в структуру учебника.
Биологическая химия изучает молекулярные процессы, лежащие в основе развития и функционирования организмов. Биохимия использует методы «молекулярных» наук — химии, физической химии, молекулярной физики, и в этом отношении биохимия сама является молекулярной наукой. Однако главные конечные задачи биохимии лежат в области биологии: она изучает закономерности биологической, а не химической формы движения материи. С другой стороны, «молекулярные изобретения» природы, открываемые биохимиками, находят применение в небиологических отраслях знания и в промышленности (молекулярная бионика, биотехнология). В таких случаях биохимия выступает в роли метода, а предметом исследований и разработок являются проблемы, выходящие за пределы биологии.
Место биохимии как молекулярного уровня биологических исследований иллюстрирует рис. В.1. Уровни исследования являются отражением уровней структурной организации биологических систем, образующих иерархический ряд от наиболее простых систем (молекулы организмов, молекулярный уровень) до предельно сложной земной биологической системы (биосферный уровень). Действительные связи между отраслями биологии гораздо сложнее, чем можно представить с помощью таких простых схем, как на рис. В.1. В частности, каждый более простой уровень организации живых систем (и, соответственно, уровень их исследования) является частью более сложных уровней. Самый первый уровень — молекулярный — уникален в том отношении, что он является составной частью систем всех других уровней биологии. Соответственно этому выделяют такие разделы биохимии, как, например, молекулярная генетика, биохимическая экология. Высший уровень — биосферный — включает в себя все другие уровни.
Первоначальные этапы истории биохимии совпадают с историей органической химии. До середины XIX в. органической химией называли науку, которая изучала вещества, входящие в состав животных и растительных организмов, т. е. вещества живого («органического») мира. Позднее, в связи с развитием синтетической химии соединений углерода, смысл термина «органическая химия» изменился — так теперь называют химию соединений углерода, а науку, изучающую химический состав живых организмов и химические процессы, протекающие в них, стали называть физиологической, а затем биологической химией. Биологическая химия изучает не только органические, но и неорганические (минеральные) соединения, содержащиеся в организмах. Разумеется, и после этой дифференциации органической и биологической химии их развитие происходит в тесном взаимодействии, объединяемое множеством общих методов и общих задач.
Историю биохимии (и органической химии) принято отсчитывать с конца XVIII в., когда впервые были выделены из организмов в чистом виде некоторые соединения — мочевина, лимонная кислота, яблочная кислота и др. В то время еще не было представлений о строении этих веществ. Длительный период развития биохимии, вплоть до середины XX в., заполнен открытием все новых веществ в живой природе, исследованием их структуры и химических превращений в организмах. Важнейшими достижениями этого периода явилось установление общего плана строения главных биополимеров — белков и нуклеиновых кислот, и раскрытие основных путей химических превращений веществ в организмах (метаболизм). В этот же период произошла дальнейшая дифференциация биохимии: в ней стали выделять статическую биохимию, изучающую химический состав организмов; динамическую биохимию, изучающую метаболизм; функциональную биохимию, изучающую связь химических процессов с физиологическими (биологическими) функциями.
Середина XX столетия явилась переломным этапом в истории биохимии. Развитие молекулярного уровня исследований в последующее время привело к перестройке структуры не только биохимии, но и всей биологии — ее методов, эмпирической основы, теоретических элементов, форм практического использования, классификации разделов биологии.
Отличительной чертой биохимии этого периода является переход к широкому изучению структуры и свойств индивидуальных представителей белков и нуклеиновых кислот, к выяснению функции каждого индивидуального белка и каждой функциональной единицы нуклеиновых кислот в живой клетке. Предпосылкой для этого послужило стремительное развитие методов разделения веществ и изучения их структуры, а также специфических для биохимии методов выделения и исследования надмолекулярных структур — клеточных органелл. Если в предшествующий период функциональная биохимия только зарождалась, то теперь она становится ведущим направлением в биохимии. По-прежнему сохраняются и усиливаются связи с органической химией, но одновременно резко возрастает значение связей биохимии с другими биологическими науками — цитологией, физиологией, генетикой. Наиболее ярким выражением этого явилось раскрытие молекулярных механизмов таких фундаментальных свойств жизни, как наследственность и изменчивость.
В 50-60-х годах XX в., когда была установлена структура ДНК, позволившая объяснить механизм репликации генов, возникло новое название для обозначения этого направления исследований — молекулярная биология. Первоначально молекулярной биологией называли область биохимии, изучающую молекулярные основы общебиологических явлений — наследственности, изменчивости, биологической эволюции. Однако очень скоро значение термина изменилось, и его стали применять в более широком смысле, вплоть до того, что некоторые биохимики считают термины «молекулярная биология» и «биохимия» синонимами.
До середины XX в. в биохимии преобладало исследование химических превращений веществ в организме, сопровождающихся изменением ковалентной структуры соединений (метаболизм). Однако со временем выяснилось, что не меньшее значение в обмене веществ и функционировании организма имеют физико-химические процессы, не связанные с изменением ковал ентной структуры соединений. Область биохимии, изучающую физико-химические и молекулярно-физичес-кие основы жизнедеятельности, называют физико-химической биологией.
Всякое изменение молекул в организме можно изучать в двух направлениях. Одно направление — выяснение роли этого процесса для функционирования живой клетки, органа, организма. В этом случае молекулярные процессы служат для объяснения биологических явлений. Другое направление — выяснение химических и физических основ этого процесса, т. е. объяснение поведения молекул в организме исходя из законов химической и физической форм движения материи. Исследования этого направления составляет содержание биоорганической химии. Биоорганическая химия занимает положение, пограничное с органической химией, в отличие от которой изучает прежде всего те свойства соединения, которые непосредственно связаны с его функцией в организме. Кроме того, биоорганическая химия, исходя из функций отдельных соединений в организме и механизма их действия, разрабатывает принципы создания синтетических биологически активных соединений, т. е. веществ, определенным образом изменяющих функции организма (лекарства, избирательно действующие инсектициды и др.).
Здесь названы основные направления биохимии, имеющие общебиологическое значение. Кроме того, в зависимости от конкретных объектов и задач исследования выделяют и другие разделы биохимии, например: биохимия вирусов, биохимия растений, биохимия животных.
Представление о белках как о классе соединений формировалось в XVIII-XIX вв. В этот период из разнообразных объектов живого мира (семена и соки растений, мышцы, хрусталик глаза, кровь, молоко и т. п.) были выделены вещества, обладающие сходными свойствами: они образовывали вязкие, клейкие растворы, свертывались при нагревании, при их высушивании получалась роговидная масса, при «анализе огнем» ощущался запах паленой шерсти или рога и выделялся аммиак. Поскольку все эти свойства ранее были известны для яичного белка, то новый класс веществ получил название белков.
В начале XIX в. появились более совершенные методы элементного анализа веществ и начались исследования элементного состава белков. В последних обнаружили углерод, водород, азот, кислород, серу и фосфор. Голландский химик и врач Г. Я. Мульдер (1802-1880) предложил первую теорию строения белков. Исходя из исследований элементного состава, Мульдер пришел к выводу, что все белки содержат одну или несколько групп (радикалов) C40H62N10O2, соединенных с серой или фосфором или с тем и другим вместе. Он предложил для обозначения этой группы термин «протеин» (от греч. протейон — первый), так как считал, что это вещество «без сомнения, важнейшее из всех известных тел органического царства, и без него, как кажется, не может быть жизни на нашей планете»*.
Представление о существовании такой группы скоро было опровергнуто, а значение термина «протеины» изменилось, и сейчас он применяется как синоним термина «белки».
Важную роль в изучении структуры белков сыграло развитие методов их разложения кислотами и пищеварительными соками. В 1820 г. А. Браконно (Франция) подвергал многочасовому действию серной кислоты кожу и другие ткани животных, затем нейтрализовал смесь, получал фильтрат, при выпаривании которого выпадали кристаллы вещества, названного им гликоколом («клеевым сахаром»). Это была первая аминокислота, выделенная из белков. Ее структурная формула установлена в 1846 г.К концу XIX в. из белков было выделено свыше десяти аминокислот. Исходя из результатов изучения продуктов гидролиза белков, немецкий химик Э. Фишер (1852-1919) предположил, что белки построены из аминокислот. Это положение послужило основанием для его многолетних исследований химии аминокислот и белков, завершившихся созданием в начале XX в. пептидной теории строения белков. В результате работ Э. Фишера стало ясно, что белки представляют собой линейные полимеры а-аминокислот, соединенных друг с другом амидной (пептидной) связью, а все многообразие представителей этого класса соединений могло быть объяснено различиями аминокислотного состава и порядка чередования разных аминокислот в цепи полимера. Однако эта точка зрения не сразу получила всеобщее признание: еще в течение трех десятилетий появлялись иные теории строения белков, в частности такие, которые основывались на представлении, что аминокислоты не являются структурными элементами белков, а образуются как вторичные продукты при разложении белков в присутствии кислот или щелочей.
Первые исследования белков проводились со сложными белковыми смесями, такими, как яичный белок, сыворотка крови, экстракты из растительных и животных тканей, а подчас и цельные ткани. Лишь в конце XIX в. получили распространение методы разделения белков с помощью осаждения нейтральными солями. В 30-е годы XX в. были получены первые белки в кристаллическом состоянии. Получение вещества в кристаллическом виде служит одним из надежных доказательств чистоты (гомогенности) препарата. В частности, в 1926 г. Д. Самнер выделил из семян канавалии белок (фермент) уреазу в кристаллическом состоянии; Д. Нортроп и М. Кунитц в 1930-1931 гг. получили кристаллы пепсина и трипсина. После этих пионерских работ выделение индивидуальных белков стало частым событием в истории биохимии, особенно после 50-х годов, когда начали применять современные методы фракционирования — хроматографию на гидрофильных ионообменниках, гель-фильтрацию («молекулярное просеивание»), новые методы электрофореза и др.
На современном этапе изучения белков основными направлениями являются следующие:
1) изучение пространственной структуры индивидуальных белков;
2) изучение механизмов функционирования индивидуальных белков (на уровне отдельных атомов и атомных групп молекулы белка);
3) изучение интегративной функции наборов белков, характерных для тех или иных субклеточных структур или типов клеток, а также для интегральных биохимических систем более высокого уровня, вплоть до целого организма и популяции организмов.
Мономерами белков служат а-аминокислоты, общим признаком которых является наличие карбоксильной группы и аминогруппы у второго углеродного атома (а-углеродный атом) Мономерами белков служат а-аминокислоты, общим признаком которых является наличие карбоксильной группы и аминогруппы у второго углеродного атома (а-углеродный атом) Встречающиеся в живой природе а-аминокислоты, как правило, имеют L-koh-фигурацию. Однако в клетках многих микроорганизмов есть и D-аминокислоты, в частности в веществе клеточной стенки и в составе некоторых антибиотиков.
В водной среде аминокислоты находятся в ионизированной форме. При рН=7, характерном для жидкостей организма, ионизированы ос-аминогруппы и ос-карбоксильные группы всех аминокислот, со-карбоксильные группы аспарагиновой и глу-таминовой кислот, е-аминогруппа лизина.
Первичной структурой называют порядок чередования (последовательность) аминокислотных остатков в белке. Даже идентичные по длине и аминокислотному составу пептиды могут быть разными веществами. Например, из двух аминокислот — аланина и тирозина — можно построить два пептида: Ala—Туг и Туг—Ala. Из трех аминокислот можно получить шесть различных по первичной структуре трипептидов. Число изомеров полипептида, построенного из п разных аминокислот, равно числу перестановок из п элементов, т. е. п\ При п = 20 число возможных изомеров равно 2«1018. Если учесть, что в составе пептидной цепи каждая из аминокислот может встречаться больше одного раза, то число изомеров становится невообразимым. Возможность составления разных белков из аминокислот так же неисчерпаема, как возможность составления разных фраз из букв алфавита. Однако в живой природе реализуются не все эти возможности. В организме человека, по приближенным оценкам, имеется около 50 ООО разных белков.После реакции выделяют ФТГ—к и идентифицируют его; допустим, он оказался фенилтиогидантоином аланина. Теперь мы можем записать последовательность исследуемого тетрапептида так: Ala—1—m—п. Затем таким же образом исследуют оставшийся после первой реакции трипептид 1—m—п и узнают второй аминокислотный остаток, и т. д. Созданы автоматические приборы — секвенато-ры, позволяющие с использованием этой реакции изучать первичную структуру карбоксильной группой метионина и аминогруппой любой другой аминокислоты. При обработке бромцианом в молекуле белка разрушаются все такие связи и образуется соответствующее число фрагментов. Для фрагментирования применяют также некоторые ферменты, избирательно гидролизующие определенные пептидные связи.
Протомеры соединяются в результате образования гидрофобных, ионных, водородных связей. При этом протомеры взаимодействуют друг с другом не любой частью своей поверхности, а определенным участком (контактная поверхность). Между каждой парой взаимодействующих контактных участков образуются десятки связей.
Процесс самосборки отличается высокой специфичностью. Если в растворе наряду с протомерами гемоглобина есть и протомеры других белков, они не образуют соединений с протомерами гемоглобина. Протомеры данного белка «находят» и «узнают» друг друга, соединяясь только друг с другом. Взаимное узнавание протомеров обусловлено особой структурой контактных поверхностей. Контактные поверхности содержат много гидрофобных аминокислотных остатков, которые при объединении протомеров образуют гидрофобное ядро олигомерного белка. При этом расположение групп, образующих связи, на одном протомере соответствует их расположению на другом протомере Если на одной поверхности имеется выступ, то на другой в соответствующем месте — углубление, в которое при контакте входит выступ; соответственно, при контакте оказываются совпадающими разноименно заряженные ионные группы или группы, способные образовать водородные связи, или гидрофобные участки поверхностей. Такого рода поверхности называют комплементарными; они подходят друг к другу, как ключ к замку Каждый протомер взаимодействует с другим в десятках точек; это означает, что ошибочное соединение (неправильная ориентация в олигомере или соединение с другими белками) практически невозможно.
Комплементарные взаимодействия молекул (не только белковых) лежат в основе всех биохимических процессов в организме.
Олигомерные белки обладают особыми свойствами, которых нету белков, не имеющих четвертичной структуры. Это можно увидеть, сравнивая белок мышц ми-оглобин и белок эритроцитов гемоглобин. Вторичная и третичная структуры ми-оглобина и протомеров гемоглобина очень сходны (ср. рис. 1.9 и 1.22). Оба эти белка являются гемопротеинами и выполняют в организме сходные функции, в основе которых лежит способность обратимо связывать кислород. Простетическая группа этих белков — гем — представляет собой плоскую молекулу, содержащую четыре пиррольных цикла и соединенный с ними атом железа (рис. 1.24).
Пептидная цепь миоглобина содержит 153 аминокислотных остатка. Из них примерно три четверти образуют восемь
ос-спиральных участков, обозначаемых латинскими буквами от А до Н. Плоская молекула гема расположена в углублении между спиралями Е и F (рис. 1.25). Гем соединяется с белковой частью (глобином) гидрофобными связями между пирроль-ными циклами и гидрофобными радикалами аминокислот. Атом железа в молекуле гема образует шесть координационных связей: четыре с атомами азота пиррольных колец гема, одну с атомом азота имидазольного кольца гистидина, расположенного в спирали F (проксимальный гистидин), и еще одну — с молекулой 02. Спираль Е содержит также остаток гистидина, не связанный с гемом (дистальный гистидин), но способствующий присоединению кислорода к иону железа.
Пиррольные кольца гема расположены в одной плоскости, в то время как атом железа в дезоксигемоглобине несколько выступает из этой плоскости (на0,6 ангстрема). Присоединение кислорода «выпрямляет» молекулу гема: железо перемещается в плоскость пиррольных колец. Поскольку железо связано с остатком проксимального гистидина пептидной цепи, то происходит и перемещение участка пептидной цепи, разрыв некоторых слабых связей в молекуле белка, т. е. несколько изменяется конформация белка. Таким образом, присоединение кислорода сопровождается изменением пространственной структуры. В этом отношении миоглобин и гемоглобин одинаковы, но следствия изменения их конформации различны.
Характерная структурная особенность фибриллярных белков — вытянутая, нитевидная форма молекул. Эти белки нерастворимы в воде и часто образуют многомолекулярные нитевидные комплексы — фибриллы.
Фибриллярный белок коллаген — самый распространенный белок в мире животных; в организме человека с массой тела 70 кг содержится от 12 до 15 кг белков, и половина этого количества приходится на коллаген. Молекула коллагена (тропоколлагена) построена из трех пептидных цепей, каждая из которых содержит около 1000 аминокислотных остатков. Необычен аминокислотный состав коллагена: каждая третья аминокислота — это глицин, 20 % составляют остатки пролина и гидроксипролина, 10 % — аланина, остальные 40 % представлены всеми другими аминокислотами. Коллаген — единственный белок, в котором содержится гидроксипролин. Эта аминокислота получается путем гидроксилирования части остатков пролина уже после образования пептидных цепей. Гидроксилиру-ется также некоторая часть остатков лизина с превращением в гидроксилизин.Каждая из пептидных цепей коллагена имеет конформацию спирали, отличающейся от а-спирали; в молекуле коллагена все'три спирали, в свою очередь, перевиты друг с другом, образуя плотный жгут (рис. 1.28). Между спиралями за счет пептидных групп образуются водородные связи (—C=0**«H—N—). Такие же водородные связи имеются и внутри каждой цепи.Молекулы коллагена, соединяясь «бок о бок», образуют микрофибриллы (см. рис. 1.28); из микрофибрилл формируются более толстые фибриллы, а из них — волокна и пучки волокон. Связи между молекулами коллагена в фибриллах ковалентные; они возникают за счет взаимодействия оксилизиновых остатков. В организме человека содержится не менее 19 разных типов коллагена. Коллагеновые волокна вместе с другими полимерными веществами межклеточного матрикса составляют основу соединительной ткани, обеспечивающую ее опорную функцию (гл. 18).
Эпидермис кожи, волосы, ногти содержат фибриллярные белки кератины. Пептидные цепи этих белков имеют конформацию а-спирали. В волосе три такие цепи, скрученные в суперспираль, образуют первичный агрегат (протофибриллу). Спиральный жгут из нескольких протофибрилл представляет собой микрофибриллу, жгут из микрофибрилл — макрофибриллу. В целом получается структура многожильного каната. В одном волосе содержатся сотни макрофибрилл, ориентированных по длине волоса. Молекулы кератина в макрофибрилле соединены друг с другом дисульфидными связями, что придает прочность и жесткость всей структуре.
Фибриллярные белки нерастворимы в воде. Они не перевариваются в пищеварительном тракте большинства животных и человека и поэтому не могут служить пищей (однако некоторые виды членистоногих, например моль и др., приспособились к питанию фибриллярными белками шерсти, кожи, перьев птиц).
Нет сомнений, что белки выполняют в живой клетке наиболее разнообразные и наиболее интересные функции. Как уже было отмечено, в организме человека количество разных белков исчисляется десятками тысяч. Каждый белок имеет уникальную, свойственную лишь ему структуру и в такой же мере уникальную функцию, отличающуюся от функций всех других белков. Некоторые белки можно объединить в группы по признаку сходства их функций:1. Транспортные белки: гемоглобин, сывороточный альбумин, трансферрин и др.; белки трансмембранного транспорта.
2. Ферменты.
3. Белки-регуляторы: белковые гормоны, белки, регулирующие действие генов, белковые ингибиторы и активаторы ферментов и других белков.
4. Структурные белки: белки нуклеосом, соединительной ткани, фибрин тромбов.
5. Защитные белки (иммуноглобулины).
6. Сократительные белки.
7. Белки, предназначенные для питания развивающегося зародыша (форма запасания аминокислот): казеин молока, овальбумин яиц, запасные белки семян растений.