Даже при одинаковой длине пептиды являются разными веществами, если они различаются по аминокислотному составу.В первом из них есть остатки лизина, глицина и серина, которых нет во втором. В то же время во втором есть остатки изолейцина, аспарагиновой кислоты и тирозина, которых нет в первом. Эти два вещества существенно различаются по химическим свойствам и разительно — по биологическим свойствам: каллидин — это гормон местного действия, регулирующий тонус кровеносных сосудов и проницаемость капилляров, а ангиотензин I физиологически нейтрален,но служит предшественником другого пептида — ангиотензина II, регулирующего кровяное давление.В нейтральной среде эта реакция протекает очень медленно, но ускоряется в присутствии кислот и щелочей. Обычно гидролиз белков проводят в запаянной ампуле в растворе соляной кислоты (6 моль/л) при 105 °С; в таких условиях полный распад происходит примерно за сутки. Затем аминокислоты гидролизата разделяют методом хроматографии на ионообменных смолах, выделяя отдельно каждую аминокислоту.В этой реакции бесцветный нингидрин превращается в продукт красно-фиолетового цвета. Измерив интенсивность окрашивания, можно рассчитать концентрацию каждой аминокислоты в гидролизате и число остатков каждой из аминокислот в исследуемом белке. Такой анализ проводят с помощью автоматических приборов — аминокислотных анализаторов (рис. 1.5). В прибор загружают гид-ролизат белка, и все остальные операции производятся автоматически. Результат анализа прибор выдает в виде графика концентраций отдельных аминокислот.
Тирозин и триптофан (в незначительной степени также и фенилаланин) поглощают ультрафиолетовое излучение с максимумом поглощения при 280 нм. На этом основан спектрофотометрический метод измерения концентрации белков в растворах. Белки можно определять также колориметрически с помощью цветных реакций. В щелочной среде ионы двухвалентной меди образуют с пептидными группами комплексы, окрашенные в фиолетовый цвет (биуретовая реакция). Но чаще всего применяют более точный метод Лоури. Он основан на комбинации би-уретового реактива со специальным реактивом на ароматические аминокислоты.
Указанные методы позволяют определить суммарное количество всех индивидуальных белков изучаемого препарата. Более трудную и гораздо более важную задачу представляет измерение концентрации какого-либо индивидуального белка в сложной смеси белков. Такого рода методы основаны на специфичности взаимодействия белков с их природными лигандами или природными и синтетическими аналогами лигандов. Один из широко применяемых методов основан на взаимодействии белков со специфическими антителами
В организмах в процессе биологической эволюции, а также в технике при разработке химических технологических процессов отбирались в качестве катализаторов такие вещества, реакции с которыми протекают очень быстро — в тысячи, в миллионы, даже в 1010 раз быстрее, чем соответствующие некаталитические реакции. Такое различие скоростей позволяет вообще пренебречь некатализируемым процессом и считать, что все вещество подвергается превращению при участии катализатора. Рассмотренный выше каталитический процесс (4) составляет основу нитрозного метода получения серной кислоты; скорость этого процесса настолько выше скорости некаталитической реакции (1), что практически все молекулы S02 превращаются в молекулы S03 при участии N02, т. е. вкладом реакции (1) в образование продукта можно пренебречь. В организме человека ежесуточно распадается около 0,5 кг глюкозы до С02 и Н20; в отсутствие катализаторов для этого при тех же физических условиях потребовалось бы около 10 ООО лет. Таким образом, и в этом случае можно считать, что практически вся глюкоза в организме распадается в катализируемых реакциях.
Рассмотренный выше пример катализа (синтез S03) представляет собой кова-лентный катализ: катализатор образует ковалентное соединение с исходным веществом. Существует и нековалентный катализ: в этом случае катализатор соединяется с реагентами за счет слабых взаимодействий, например адсорбционных. Однако во всех случаях общим для катализа является то, что катализатор открывает новый путь превращения вещества через новые промежуточные состояния в те же продукты, которые могут образоваться и без катализатора. В реакциях, катализируемых ферментами, в промежуточных продуктах возникают как ковален-тные, так и нековалентные связи.
Скорость реакции чаще всего определяется ее энергией активации, т. е. той энергией, которую нужно сообщить молекулам, чтобы началось химическое превращение (рис. 2.1).
Чем больше энергия активации, тем меньше скорость реакции. Энергия активации зависит от природы реагирующих молекул, от их внутреннего строения. Например, энергия активации реакции S02 с кислородом больше, чем энергия активации реакции S02 с N02. Источником энергии активации обычно служит тепловое движение молекул (поэтому при повышении температуры скорость реакций увеличивается).Энергия активации быстро протекающих катализируемых реакций ниже, чем энергия активации соответствующих некатализируемых реакций. На этом основании часто говорят, что катализатор снижает энергию активации реакции. Однако надо помнить, что катализируемая реакция — это другая реакция, и было бы точнее говорить, что в присутствии катализатора реакцию с высокой энергией активации заменяет реакция с низкой энергией активации.
Ферменты — это белки, и, подобно всем белкам, они могут избирательно присоединять определенные вещества — лиганды. Однако в отличие от прочих белков фермент катализирует химическое превращение лиганда. Лиганд, подвергающийся химическому превращению, называют субстратом фермента; продукты реакции освобождаются в раствор. Учение о ферментах (энзимология) традиционно занимает одно из ведущих мест в биохимии. Это объясняется той важной ролью, которую играют ферменты: любые химические превращения веществ в организме происходят при их участии. Однако есть и другая причина особого внимания к ферментам, не связанная с их биологической ролью. Дело в том, что ферменты, в отличие от большинства других белков, сравнительно легко обнаруживать и измерять их количество по катализируемой ими реакции. Многие свойства, характерные для всех белков, вначале были изучены на ферментах. Такие понятия, как активный центр, ингибиторы, изоферменты (изобелки), аллостери-ческая регуляция, возникли и сложились в энзимологии, и лишь позднее они распространились на другие белки.
Ферменты, как и другие катализаторы, не изменяют состояния равновесия, а лишь ускоряют его достижение. Например, если внести фумаразу в раствор фумаровой кислоты, то можно зарегистрировать реакцию фумарат -> малат*; если же внести тот же фермент в раствор яблочной кислоты (малат), то можно наблюдать реакцию малат -> фумарат. И в том и в другом случае достигается равновесное состояние, при котором отношение [фумарат] / [малат] = Напомним, что химические реакции самопроизвольно протекают в направлении, которое связано с уменьшением в системе свободной энергии AG (энергии Гиббса) — экзергони-ческие реакции. Реакции, связанные с увеличением свободной энергии (эндерго-нические реакции), не могут протекать самопроизвольно. Но все же они возможны, если имеются внешний источник и механизм использования энергии; при этом общая энергия Гиббса системы эндергонической реакции и системы, поставляющей энергию, уменьшается.
В качестве меры возможности и направления реакции обычно используют изменение стандартной свободной энергии реакции AG0 — термин, применяемый для описания изменений в условиях, когда концентрации исходных веществ и продуктов реакции поддерживаются на уровне 1 моль/л (AG без надстрочного индекса 0 — изменение свободной энергии при любых условиях). Гидролизуемые в этих реакциях связи называют высокоэнергетическими (макроэргическими) и обозначают знаком ~ (тильда). Отметим, что энергия освобождается при любых реакциях гидролиза, но в меньших количествах, чем при гидролизе макроэргических связей (подробнее об этих связях см. в гл. 8).
Рассмотрим следующий пример. Глутамин в водном растворе самопроизвольно гидролизуется с образованием глутамата и аммиака
Реакции трансаминирования проходят в две стадии (полуреакции). Если к раствору фермента добавить только один из двух субстратов — аланин, то произойдет первая полуреакция (рис. 2.8). Аминогруппа аланина присоединяется к углероду альдиминной группы фермента: альдиминная связь между кофермен-том и белком заменяется на альдиминную связь между коферментом и аланином. Далее происходит внутримолекулярная перестройка в области альдиминной связи (см. рис. 2.8) и затем гидролиз с образованием аминогруппы на коферменте и кетогруппы на бывшей аминокислоте (теперь это уже сх-кетокислота). В целом в результате этой полуреакции пиридоксальфосфат (точнее, пиридоксальдимин фосфат) превращается в пиридоксаминфосфат, а аланин — в пировиноградную кислоту:Конечно, в этом процессе участвуют и функциональные группы белковой части фермента, а не только кофермент. Субстратная специфичность разных аминот-рансфераз определяется исключительно белковой частью, поскольку кофермент во всех случаях один и тот же. Специфичность пути превращения также зависит от белковой части, поскольку пиридоксальфосфат функционирует в качестве ко-фермента не только в реакциях трансаминирования, но и в некоторых реакциях других типов (изомеризация, декарбоксилирование, дегидратация).
В реакциях, катализируемых этими ферментами, в качестве кофермента участвует никотинамидадениндинуклеотид (НАД). Две половины молекулы НАД,объединенные связью между остатками фосфорной кислоты, построены по одинаковому плану (рис. 2.9). Одна половина представляет собой остаток нуклеотида (адениловой кислоты). Другая половина тоже нуклеотид; его азотсодержащая гетероциклическая группа представлена амидом никотиновой кислоты. Никотиновая кислота — это витамин PP.НАД-зависимые дегидрогеназы катализируют реакции окисления веществ путем дегидрирования; при этом окисляемое вещество служит донором водорода (ДН2), а НАД выполняет роль акцептора водорода, т. е. восстанавливается. Остаток никотинамида в молекуле НАД принимает непосредственное участие в реакции Отметим, что из двух атомов водорода (2 протона + 2 электрона), отщепляемых от субстрата, к НАД присоединяются один протон (второй переходит в среду) и два электрона, в результате чего утрачивается положительный заряд пиридинового цикла НАД.
Молекула кофермента А построена из аденозин-3'-фосфат-5'-пирофосфата, соединенного сложноэфирной связью с пантотеновой кислотой, которая, в свою очередь, соединена амидной связью с р-меркаптоэтиламином (тиоэтанолами-ном) — см. рис. 2.15.
Пантотеновая кислота является витамином. Кофермент А участвует во множестве превращений карбоновых кислот в живой клетке. Карбоновые кислоты присоединяются своей карбоксильной группой к SH-группе кофермента А, образуя тиоэфирную связь. Эта связь имеет высокоэнергетический характер. В уравнениях реакций кофермент изображают символом HS-KoA, а ацильные производные — ацил-S-KoA или просто ацил-КоА (ацетил-КоА, пальмитил-КоА, сукцинил-КоА и т. п.).В этой реакции АТФ используется в качестве источника энергии при образовании высокоэнергетической тиоэфирной связи в ацил-КоА. Ацильный остаток в составе ацил-КоА может подвергаться многообразным превращениям или может быть перенесен без изменений на другое вещество. Реакции переноса катализируются ферментами группы ацилтрансфераз.Из рассмотренных примеров видно, что каждый из коферментов может существовать в двух формах, циклически превращающихся друг в друга: ФАД и ФАД*Н2, КоА и ацил-КоА, и т. д. Некоторые коферменты можно рассматривать как часть активного центра фермента, например пиридоксальфосфат, ФАД, ФМН. Другие же участвуют в ферментативных реакциях скорее как субстраты (регенерирующиеся субстраты) — НАД, КоА; в этом случае превращение кофермента из одной формы в другую может происходить в результате действия двух разных ферментов. Например, превращение КоА в ацил-КоА катализирует ацил-КоА-синтетаза, а регенерация КоА происходит при действии ацилтрансферазы.
Метаболизмом называют химические превращения веществ в организме (от греч. metabole — изменение, превращение). Вещества, участвующие в метаболизме, называют метаболитами. Метаболизм — результат действия ферментов: все реакции, определяющие баланс веществ в живой клетке, катализируются ферментами.
В живой клетке имеются многие тысячи разных веществ. Каждое из них в принципе может реагировать со многими другими. Однако фактически каждое вещество участвует в немногих реакциях, часто только в одной. Например, в мышечных клетках практически вся глюкоза реагирует только с АТФ, превращаясь в глюкозо-6-фосфат. Это происходит потому, что в этих клетках есть фермент, катализирующий реакцию образования глюкозо-6-фосфата; ферментов, которые катализировали бы другие в принципе возможные реакции глюкозы, в мышцах нет, а некатализируемые реакции протекают настолько медленно, что практически не оказывают влияния на баланс глюкозы. Глюкозо-6-фосфат затем превращается в другой метаболит, тоже при участии специального фермента, и т. д. Таким образом, получается определенная последовательность реакций и метаболитов — метаболический путь глюкозы. Каждый метаболит образуется из предшественника при участии специфического фермента и, в свою очередь, служит субстратом для следующего фермента. Аналогично и другие вещества превращаются по характерным для них метаболическим путям. Метаболические пути всех веществ связаны друг с другом общими метаболитами, образуя единую сетку реакций.Таким образом, ферментативный катализ в живой клетке служит инструментом отбора определенных реакций из множества возможных. В ходе биологической эволюции возник набор ферментов, катализирующих лишь те реакции, которые оказались полезными для живой системы. В результате в организме существует не хаос реакций, а определенная система реакций — метаболизм.
Говоря о метаболизме, чаще всего имеют в виду превращения низкомолекулярных веществ, и метаболитами обычно называют низкомолекулярные вещества. Однако многие ферменты катализируют химические изменения (модификацию) высокомолекулярных соединений: удаление части мономеров, добавление новых мономеров, присоединение других веществ, например присоединение фосфорной кислоты к белкам при образовании фосфопротеина или присоединение углеводов при образовании гликопротеинов, и т. п. В результате таких перестроек изменяются функциональные свойства полимеров, поэтому многие реакции модификации полимеров играют важную роль в регуляции метаболизма.
Промежуточное место между метаболизмом низкомолекулярных соединений и реакциями модификации макромолекул занимают реакции синтеза полимеров, в том числе белков и самих ферментов, а также реакции распада полимеров на мономеры в тканях и распада полимерных веществ пищи в желудочно-кишечном тракте. Число ферментов, естественными субстратами которых являются полимеры, превышает число ферментов, действующих на низкомолекулярные субстраты.
Многие ферменты могут обратимо связывать определенные метаболиты, ингиби-рующие или активирующие фермент. Такие метаболиты называют эффекторами.
Эффектор присоединяется не к каталитическому активному центру фермента, а к специальному регуляторному центру, который называют также аллостеричес-ким центром («в другом месте расположенный центр»). Аллостерические ферменты построены, как правило, из двух или большего числа субъединиц. На рис. 2.25 представлена схема аллостерического ингибирования фермента. Одна субъединица имеет каталитический центр (каталитическая субъединица), другая — регуля-торный центр (регуляторная субъединица). В отсутствие аллостерического ингибитора субстрат присоединяется к каталитическому активному центру и происходит реакция. Если в среде есть аллостерический ингибитор, он присоединяется к регуляторному центру, что ведет к изменению конформации регуляторной субъединицы; вследствие этого изменяется конформация и каталитической субъединицы, в том числе каталитического активного центра. В результате активность фермента снижается. Чем выше концентрация аллостерического ингибитора, тем больше молекул фермента блокируется им и тем меньше скорость превращения субстрата. Аналогично происходит и активация ферментов при действии аллосте-рических активаторов.Метаболический путь синтеза УТФ включает восемь реакций. Первая реакция катализируется ферментом карбамоилфосфатсинтетазой П. Продукт реакции — карбамоилфосфат — образуется из диоксида углерода, амидной группы глутамина и фосфатного остатка АТФ; АТФ служит также источником энергии. Карбамоил-фосфатсинтетаза II — это аллостерический фермент; конечный продукт метаболического пути (УТФ) является его аллостерическим ингибитором. Чем больше концентрация УТФ, тем меньше скорость первой реакции, а значит, и всех остальных реакций, поскольку для них образуется мало субстратов. Таким способом скорость синтеза УТФ уравнивается со скоростью его расходования, т. е. с потребностью клетки в этом веществе. Здесь мы имеем дело с регуляцией по механизму отрицательной обратной связи. В последующих главах описаны многие другие примеры аллостерической регуляции.