В настоящее время известно множество белков, для которых найдены аллельные формы. Для их обнаружения требуются массовые обследования, поэтому применяют несложные методы, позволяющие быстро провести анализ большого числа образцов. Наиболее часто используют электрофорез. Применение других методов (ДНК-зонды, полимеразная цепная реакция и др.) открывает все новые варианты, не обнаруживаемые методом электрофореза. Есть основания думать, что для значительной части из десятков тысяч структурных локусов генома человека имеются аллели. Это значит, что число разных генотипов может быть практически неисчерпаемым.
Полиморфизм белков, а следовательно, и других биохимических структур и процессов настолько велик, что можно говорить о биохимической индивидуальности. О каждом человеке можно сказать, что нет в мире такого же, не было никогда прежде и не будет после того, как он умрет. С биохимической индивидуальностью связаны и индивидуальные особенности развития и здоровья.
Введение витамина В12 быстро излечивает злокачественную анемию. Однако при этом выяснилось, что имеет значение способ введения: внутримышечные инъекции излечивают анемию, а прием витамина через рот не излечивает. Если же витамин В12 принимать перорально вместе с желудочным соком, тоже наступает излечение. Отсюда следует, что в желудочном соке содержится какое-то вещество, необходимое для усвоения витамина В12 при его введении через рот. Это вещество (внутренний фактор, фактор Касла) сейчас выделено: им оказался гли-копротеин, который у здоровых людей синтезируется в клетках желудка и секре-тируется в желудочный сок. Внутренний фактор избирательно связывает витамин В12 (одна молекула витамина на одну молекулу белка); затем, уже в кишечнике, этот комплекс присоединяется к специфическим рецепторам мембраны энтероцитов, и происходит перенос витамина через их мембрану, т. е. всасывание.
Злокачественная анемия обычно развивается как осложнение гастрита, причем таких его форм, при которых резко снижается образование желудочного сока. Отсюда такие симптомы, как боли в области желудка, отсутствие аппетита. В желудке при этом нет внутреннего фактора и, следовательно, невозможно всасывание витамина В12: витамин, содержащийся в пище, выводится с калом. Развитие анемии — это уже следствие недостатка витамина В12 в тканях.
Витамин В12 выполняет коферментные функции. В организме человека есть две коферментные формы витамина В12 (кобаламина): метилкобаламин — в цитоплазме и дезоксиаденозилкобаламин — в митохондриях. В метилкобаламине вместо аденозильной группы, связанной с атомом кобальта (см. рис. 6.1), имеется метальная группа. В развитии анемии основная роль принадлежит дефициту ме-тилкобаламина, который служит коферментом в реакциях трансметилирования (подробнее об этих реакциях см. в гл. 11). Реакции траснметилирования происходят, в частности, при синтезе нуклеотидов и нуклеиновых кислот. Поэтому при недостатке метилкобаламина синтез нуклеиновых кислот нарушается. Это проявляется прежде всего в тканях с интенсивной клеточной пролиферацией. К их числу относится и кроветворная ткань. Деление и созревание клеток эритроци-тарного ряда нарушаются, размеры клеток превышают нормальные, значительная часть клеток — предшественников эритроцитов разрушается еще в костном мозге. В циркулирующей крови количество эритроцитов резко уменьшено, размеры их увеличены. При отсутствии лечения наступают изменения и в других тканях, и болезнь заканчивается гибелью больного. Введение 100-200 мкг витамина В12 ежедневно в течение примерно двух недель излечивает болезнь.
Другая коферментная форма витамина В12 — дезоксиаденозилкобаламин, участвует в метаболизме метилмалоновой кислоты, которая получается в организме из жирных кислот с нечетным числом углеродных атомов, а также из аминокислот с разветвленной углеродной цепью (подробнее об этом см. в гл. 10). При дефиците витамина В12 метилмалоновая кислота накапливается в организме и в больших количествах выводится с мочой; ее определение в моче используется для диагностики злокачественной анемии.
Обычно в метаболическом пути есть реакция, протекающая значительно медленнее, чем все другие реакции данного пути, — это лимитирующая стадия. Лимитирующая стадия определяет общую скорость превращения исходного вещества в конечный продукт метаболической цепи. Часто фермент, катализирующий лимитирующую реакцию, является регуляторным ферментом: его активность может изменяться при действии клеточных ингибиторов и активаторов, или может изменяться количество фермента в результате индукции или репрессии сто синтеза.
В разветвленных метаболических системах регуляторные ферменты обычно катализируют первую реакцию в месте разветвления, например реакции b -+ с или b -+ i на рис. 6.5. Этим обеспечивается возможность независимой регуляции каждой ветви метаболической системы.Многие реакции метаболизма обратимы; направление их протекания в живой клетке определяется расходованием продукта в последующей реакции или удалением продукта из сферы реакции, например, путем экскреции (рис. 6.5). При изменениях состояния организма (прием пищи, переход от покоя к двигательной активности и др.) концентрации метаболитов в организме изменяются, т. е. устанавливается новое стационарное состояние.
При постоянных условиях среды многие характеристики организма сохраняются неизменными. В частности, это относится к концентрации ряда метаболитов в клетках и внеклеточных жидкостях. Например, измеряя у одного и того же человека концентрацию глюкозы в крови в одинаковых условиях (после ночного сна, до завтрака), мы обнаружим, что она день за днем, месяц за месяцем остается практически постоянной (или изменяется в узких пределах). Средние значения этих концентраций (с указанием пределов колебаний) служат одной из характеристик нормы. При болезнях стационарные концентрации метаболитов изменяются, причем эти изменения часто бывают специфичными для той или иной болезни. На этом основаны многие биохимические методы лабораторной диагностики болезней.
Такое постоянство многих свойств организма называют гомеостазом. Гомеос-таз поддерживается действием специальных регуляторных механизмов.
Однако еще более, чем гомеостаз, характерны для организма изменения ряда параметров, происходящие в определенном направлении и имеющие определенную величину.
Лизосомы — это клеточные органеллы, выполняющие роль «уборщиков мусора». Они представляют собой мембранные пузырьки, в которых находятся гидролитические ферменты. Набор гидролаз в лизосомах такой, что они могут деполимери-зовать любые полимеры, имеющиеся в организме — белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, липиды. Понятно, что такие ферменты должны быть изолированы от остальной части клетки, чтобы не разрушить ее. Однако эти ферменты лизосом, будучи белками, должны быть и сами каким-то образом защищены от действия протеолитических ферментов. Часто это достигается тем, что ферменты лизосом в высокой степени гликозилированы и поэтому являются плохими субстратами для протеаз.
Лизосомы поглощают и разрушают компоненты, которые поступают в клетку путем эндоцитоза (гетерофагия), а также компоненты клетки после ее гибели (аутофагия). Характерной особенностью содержимого лизосом является кислая реакция среды (рН 1 5), в то время как в других частях клетки реакция близка к нейтральной. Кислая среда в лизосомах создается за счет действия Н+-АТФазы в мембране, перекачивающей протоны внутрь лизосом. Лизосомы, как и плазматическая мембрана, образуются в пластинчатом комплексе (первичные лизосомы).
Гетерофагия. Этот процесс является совокупным результатом эндоцитоза и действия лизосом. Эндоцитозные пузырьки в цитоплазме сливаются с первичными лизосомами, образуя вторичные лизосомы (см. рис. 7.22). Содержимое эндоцитозного пузырька во вторичной лизосоме деполимеризуется, и мономеры утилизируются клеткой. Иногда эндоцитируются вещества, которые не перевариваются ферментами лизосом: они сохраняются в лизосоме, образуя остаточное тельце. В некоторых случаях остаточные тельца могут удаляться из клетки путем слияния лизосомы с плазматической мембраной (экзоцитоз, см. рис. 7.22).
Наиболее известный пример гетерофагии связан с фагоцитозом бактерий: этот процесс — существенное звено механизмов защиты от инфекций. Некоторые микроорганизмы имеют поверхностную структуру (капсулу), которая препятствует их присоединению к лейкоцитам, и таким образом они избегают фагоцитирования. Однако при иммунном ответе образуются антитела к веществам капсулы бактерий; антитела покрывают поверхность бактерий, и они фагоцитируются лейкоцитами, имеющими рецепторы для антител. Затем эндоцитозный (фагоцитозный) пузырек сливается с первичной лизосомой, и бактерии разрушаются.
Микроорганизмы, паразитирующие внутриклеточно (возбудители проказы, туберкулеза, бруцеллеза и др.), а также некоторые вирусы используют механизм эндоцитоза для проникновения в клетки. Разрушающего действия лизосом они избегают разными способами: одни имеют ингибиторы, препятствующие слиянию эндоцитозных пузырьков с лизосомами; у других есть механизмы защиты от лизосомных ферментов, и они паразитируют внутри лизосом.
Хотя значение фагоцитоза патогенных микроорганизмов очевидно, однако основную массу эндоцитируемого и затем поступающего в лизосомы материала составляют собственные стареющие и погибающие клетки, клеточные фрагменты, растворенные макромолекулы организма. Например, у человека фагоциты каждый день удаляют из кровотока около 3*1011 эритроцитов ('/120 часть всех эритроцитов). Пигментные эпителиальные клетки сетчатки эндоцитируют «состарившиеся» части наружных сегментов палочек. Нарушение этой функции пигментных клеток ведет к пигментозному ретиниту и слепоте. Таким образом, гетерофагия, вместе с пролиферацией клеток, обеспечивает обновление клеточных популяций организма.
Еще одна функция гетерофагии связана с питанием клетки. Всякий акт эндоцитоза и последующей деполимеризации в лизосомах пополняет клеточный фонд веществ. Кроме того, есть формы гетерофагии, специально направленные на доставку в клетки определенных веществ.
Человек, как и все гетеротрофные организмы, получает энергию за счет разложения органических веществ пищи. Органические вещества в условиях поверхности Земли являются термодинамически нестабильными: они самопроизвольно (необратимо) распадаются. Самопроизвольные процессы — это экзергоничес-кие процессы, т. е. они сопровождаются уменьшением свободной энергии (-AG), и поэтому могут служить источниками энергии для функционирования живой клетки. В результате самопроизвольного распада в конечном счете образуются термодинамически стабильные продукты. Такими конечными продуктами распада пищевых веществ в организме человека являются диоксид углерода и вода. Еще один из основных конечных продуктов обмена — это мочевина. Она не относится к числу термодинамически стабильных веществ; образование мочевины связано с энергетическим обменом лишь косвенно и служит для выведения избытка азота из организма, поэтому синтез мочевины подробнее рассматривается в связи с обменом аминокислот в гл. 11.
Термодинамически нестабильные вещества могут быть достаточно стабильными кинетически. Например, глюкоза вне организма может сохраняться столетиями, в то время как в организме человека ежесуточно распадается примерно 0,5 кг глюкозы. Кинетическая стабильность в живой клетке преодолевается в результате ферментативного катализа. Основными веществами, за счет которых организм человека обеспечивается энергией, служат углеводы и жиры пищи (табл. 8.1). Меньшее значение имеют белки, однако при преимущественно белковом питании и при голодании их роль значительно возрастает.В углеводах, жирах и белках (аминокислотах) содержание кислорода меньше, чем в конечных продуктах их распада. Иначе говоря, катаболизм этих веществ связан с потреблением кислорода и реакциями окисления. В этом и состоит сущность дыхания, впервые объясненная Лавуазье.
В окислительно-восстановительных реакциях изменения свободной энергии пропорциональны способности реагентов отдавать или получать электроны. Поэтому описание изменений свободной энергии возможно не только в терминах AG0, но и в численной форме, в величинах окислительно-восстановительных потенциалов (Е°). Отношения между Е° и G0 описываются уравнением.Общая разность окислительно-восстановительных потенциалов между НАДН и 02 равна: 1,14 В [0,82 - (-0,32) = 1,14]; этому соответствует разность свободных энергий AG, равная -220 кДж в пересчете на каждую пару переносимых электронов. Такого количества энергии хватило бы на синтез четырех молекул АТФ. Однако в действительности может синтезироваться не более трех молекул АТФ. Отметим, что энергия синтеза воды из молекулярного водорода и молекулярного кислорода равна 230 кДж/моль, т. е. несущественно отличается от энергии синтеза воды при переносе водорода с НАДН на молекулярный кислород в живой клетке.
Ферменты цепи переноса электронов фиксированы в митохондриальной мембране таким образом, что их действие векторно, т. е. характеризуется не только величиной скорости реакции, но и пространственной направленностью, подобно действию транспортных АТФаз. Основным проявлением векторности в дыхательной цепи является перенос ионов водорода с внутренней стороны мембраны (со стороны матрикса) на наружную (в межмебранное простраство).
В дыхательной цепи есть три пункта, связанные с перекачкой протонов: комплексы I, III и IV (см. рис. 8.3).
Кофермент Q при участии НАДН-дегидрогеназы (комплекс I) присоединяет электроны (а также протоны) от компонентов дыхательной цепи с матриксной стороны мембраны, а освобождаются электроны и протоны на противоположной стороне мембраны, причем электроны акцептируются очередным компонентом дыхательной цепи, а протоны уходят в межмембранное пространство. Такой механизм называют Q-циклом. Сходным образом действует и цитохром-с-редуктаза (комплекс III). В области цитохромоксидазы (комплекс IV) в перекачке протонов, возможно, участвуют ионы Си2+.
Перенос двух электронов через каждый комплекс обеспечивает перекачку четырех протонов. Таким образом, цепь переноса электронов работает как протонный насос, перекачивая ионы водорода из матрикса на наружную сторону мембраны.
В результате по сторонам мембраны возникает разность концентраций протонов и одновременно разность электрических потенциалов со знаком «плюс» на наружной поверхности. Иначе говоря, энергия разности окислительно-восстановительных потенциалов веществ трансформируется в энергию протонного электрохимического потенциала АрН+.
Электрохимический потенциал понуждает протоны двигаться в обратном направлении — с наружной поверхности внутрь. АТФ-синтетаза — очень крупный олигомерный белок, в котором выделяют три части: выступающую в матрикс митохондрии часть (F1), построенную из трех пар димеров сф; трансмембранную часть (F0), образующую гидрофильный канал, и промежуточную область FA. Субъединица F1 содержит активные центры, синтезирующие АТФ. Протоны движутся через канал АТФ-синтазы, и энергия этого движения используется для образования АТФ. Конкретные механизмы сопряжения, т. е. трансформации электрохимического потенциала в энергию макроэргической связи АТФ, все еще не вполне ясны.
Образующаяся АТФ при участии АДФ-АТФ-транслоказы транспортируется из матрикса на наружную сторону мембраны и попадает в цитозоль. Одновременно та же транслоказа переносит АДФ в обратном направлении, из цитозоля в матрикс митохондрии.
В искусственных условиях, в опытах in vitro можно создать избыток АТФ со стороны внутренней поверхности внутренней мембраны. В этом случае реакция идет справа налево, т. е. фермент работает как транспортная АТФаза, переносящая протоны (Н+-АТФаза). Мембрана при этом энергизуется: АрН+ возникает за счет энергии гидролиза АТФ.
Общий путь катаболизма — это прежде всего путь поставки водорода органических веществ в дыхательную цепь.В живой клетке энергия, заключенная в пирувате, извлекается иным путем — с участием реакций дегидрирования: всего в общем пути катаболизма происходит пять реакций дегидрирования, в которых участвует 10 атомов водорода. Но пиро-виноградная кислота содержит только 4 атома водорода, т. е. только на две реакции дегидрирования. Еще б атомов водорода поступает из двух молекул воды, потребляемых в реакциях цитратного цикла (реакции 1 и 9 на рис. 8.12), и из одной-молекулы воды, которая получается в реакции 7 при превращении ГДФ и Н3Р04 в ГТФ. Следовательно, водород трех молекул воды (в расчете на 1 молекулу пирувата) включается в метаболиты цитратного цикла и в конечном счете попадает в гидрированные коферменты — НАДН или QH2.Для непрерывного протекания реакций общего пути катаболизма кофермен-ты, перешедшие в восстановленное состояние, должны снова окислиться. Их окисление происходит путем переноса водорода с коферментов на атмосферный кислород в митохондриальной дыхательной цепи (см. рис. 8.1). Таким образом, общий путь катаболизма и дыхательная цепь представляют собой единый процесс, и эти две его части не могут функционировать отдельно одна от другой.
Энергия переноса водорода с дегидрируемых субстратов общего пути катаболизма на атмосферный кислород используется для синтеза АТФ. При переносе водорода с каждой молекулы НАДН в дыхательной цепи образуется 3 молекулы АТФ. В четырех реакциях дегидрирования в общем пути катаболизма образуется 4 НАДН; следовательно, синтезируется 4x3= 12 молекул АТФ. В одной реакции (катализируемой сукцинатдегидрогеназой) водород переносится на убихинон; при дальнейшем переносе в дыхательной цепи в этом случае синтезируется 2 молекулы АТФ. И, наконец, в цитратном цикле происходит одна реакция субстратного фосфорилирования, дающая еще одну молекулу АТФ. Таким образом всего при распаде 1 моль пирувата образуется 15 моль АТФ. Отметим, что 3 из них образуются при окислительном декарбоксилировании пирувата и 12 — в цитратном цикле. Эти величины отражают теоретически возможный максимум синтеза АТФ; фактически АТФ синтезируется меньше, поскольку часть электрохимического потенциала расходуется на перенос разных веществ через мембрану при участии транслоказ.
Общий путь катаболизма выполняет и анаболические функции. Это проявляется в том, что некоторые промежуточные продукты используются для синтеза структурно-функциональных компонентов клетки. Пируват, а-кетоглутарат и оксалоа-цетат являются кетоаналогами соответственно аланина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты и путем трансаминирования могут превращаться в эти аминокислоты. Ацетил-КоА служит предшественником жирных кислот. Сукцинил-КоА используется для синтеза гема.
В результате каждого оборота цитратного цикла регенерируется щавелевоук-сусная кислота, необходимая для начала следующего оборота цикла. Поэтому удаление щавелевоуксусной кислоты или ее предшественников в цикле в другие метаболические процессы привело бы к прерыванию цикла. Это предотвращается тем, что отток метаболитов цитратного цикла компенсируется их образованием в других реакциях. Такие реакции называют анаплеротическими (пополняющими). Основная анаплеротическая реакция — превращение пировиноградной кислоты в щавелевоуксусную кислоту, главным образом в реакции, катализируемой пиру-ваткарбоксилазой:Пируваткарбоксилаза содержится только в митохондриях. Фермент построен из четырех субъединиц, каждая из которых содержит прочно связанный ион Мп2+ и витамин биотин, выполняющий коферментную функцию (рис. 8.14). Биотин соединен с ферментом амидной связью через е-аминогруппу остатка лизина.В ходе реакции С02 вначале присоединяется к биотину (получается карбоксибиотин), затем переносится на пируват.
Другие анаплеротические реакции связаны с образованием пропионил-КоА из валина, изолейцина и жирных кислот с нечетным числом углеродных атомов; пропионил-КоА затем превращается в сукцинил-КоА (рис. 8.15). Кроме того, глу-таминовая и аспарагиновая кислоты могут превращаться путем трансаминирова-ния в ос-кетоглутаровую и щавелевоуксусную кислоты соответственно. При катаболизме тирозина образуется фумаровая кислота.
При синтезе многих соединений в живой клетке происходят реакции восстановления путем гидрирования. Источником водорода для восстановительных синтезов служат некоторые метаболиты цитратного цикла, а промежуточным переносчиком водорода в таких реакциях является НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфос-фат). Механизм участия НАДФ в реакциях переноса водорода такой же, как и у НАД: один протон и два электрона присоединяются к пиридиновому циклу остатка никотинамида, один протон остается в растворе. Однако биологические функции НАДФ и НАД различны.
Метаболит цитратного цикла — яблочная кислота, может дегидрироваться с участием НАДФ-зависимой дегидрогеназы. НАДФ-зависимая малатдегидрогеназа (малик-фермент) локализована в цитозоле клетки. В отличие от митохондриаль-ной НАД-зависимой малатдегидрогеназы (см. рис. 8.13, реакция 10), НАДФ-зависимая малатдегидрогеназа катализирует одновременно с дегидрированием и декарбоксилирование малата:НАДФН, в отличие от НАДН, не может передавать водород в дыхательную цепь: водород НАДФН используется в восстановительных реакциях. Особенно много восстановительных реакций происходит при синтезе жирных кислот и стероидов; в органах с интенсивным синтезом этих веществ (печень, жировая ткань, кора надпочечников) высока и активность НАДФ-зависимых дегидрогеназ. Малат поставляет примерно половину всего водорода, используемого в восстановительных синтезах; другая половина образуется в пентозофосфатном пути распада глюкозы (см. гл. 9).
При восстановительных синтезах энергия высокоэнергетического водорода НАДФН не теряется: она сохраняется во вновь синтезированных веществах и во многих случаях может быть использована при их катаболизме. Особенно важное значение имеет такая трансформация энергии при превращении углеводов, поступающих с пищей, в жиры, депонируемые в жировой ткани (см. гл. 9 и 10).