В организмах в процессе биологической эволюции, а также в технике при разработке химических технологических процессов отбирались в качестве катализаторов такие вещества, реакции с которыми протекают очень быстро — в тысячи, в миллионы, даже в 1010 раз быстрее, чем соответствующие некаталитические реакции. Такое различие скоростей позволяет вообще пренебречь некатализируемым процессом и считать, что все вещество подвергается превращению при участии катализатора. Рассмотренный выше каталитический процесс (4) составляет основу нитрозного метода получения серной кислоты; скорость этого процесса настолько выше скорости некаталитической реакции (1), что практически все молекулы S02 превращаются в молекулы S03 при участии N02, т. е. вкладом реакции (1) в образование продукта можно пренебречь. В организме человека ежесуточно распадается около 0,5 кг глюкозы до С02 и Н20; в отсутствие катализаторов для этого при тех же физических условиях потребовалось бы около 10 ООО лет. Таким образом, и в этом случае можно считать, что практически вся глюкоза в организме распадается в катализируемых реакциях.
Рассмотренный выше пример катализа (синтез S03) представляет собой кова-лентный катализ: катализатор образует ковалентное соединение с исходным веществом. Существует и нековалентный катализ: в этом случае катализатор соединяется с реагентами за счет слабых взаимодействий, например адсорбционных. Однако во всех случаях общим для катализа является то, что катализатор открывает новый путь превращения вещества через новые промежуточные состояния в те же продукты, которые могут образоваться и без катализатора. В реакциях, катализируемых ферментами, в промежуточных продуктах возникают как ковален-тные, так и нековалентные связи.
Скорость реакции чаще всего определяется ее энергией активации, т. е. той энергией, которую нужно сообщить молекулам, чтобы началось химическое превращение (рис. 2.1).
Чем больше энергия активации, тем меньше скорость реакции. Энергия активации зависит от природы реагирующих молекул, от их внутреннего строения. Например, энергия активации реакции S02 с кислородом больше, чем энергия активации реакции S02 с N02. Источником энергии активации обычно служит тепловое движение молекул (поэтому при повышении температуры скорость реакций увеличивается).Энергия активации быстро протекающих катализируемых реакций ниже, чем энергия активации соответствующих некатализируемых реакций. На этом основании часто говорят, что катализатор снижает энергию активации реакции. Однако надо помнить, что катализируемая реакция — это другая реакция, и было бы точнее говорить, что в присутствии катализатора реакцию с высокой энергией активации заменяет реакция с низкой энергией активации.
Ферменты — это белки, и, подобно всем белкам, они могут избирательно присоединять определенные вещества — лиганды. Однако в отличие от прочих белков фермент катализирует химическое превращение лиганда. Лиганд, подвергающийся химическому превращению, называют субстратом фермента; продукты реакции освобождаются в раствор. Учение о ферментах (энзимология) традиционно занимает одно из ведущих мест в биохимии. Это объясняется той важной ролью, которую играют ферменты: любые химические превращения веществ в организме происходят при их участии. Однако есть и другая причина особого внимания к ферментам, не связанная с их биологической ролью. Дело в том, что ферменты, в отличие от большинства других белков, сравнительно легко обнаруживать и измерять их количество по катализируемой ими реакции. Многие свойства, характерные для всех белков, вначале были изучены на ферментах. Такие понятия, как активный центр, ингибиторы, изоферменты (изобелки), аллостери-ческая регуляция, возникли и сложились в энзимологии, и лишь позднее они распространились на другие белки.
Наиболее характерная черта, отличающая ферменты от других катализаторов — высокая специфичность их действия. Активный центр ферментов, как и других белков, образован боковыми группами аминокислотных остатков пептидной цепи. Строение активных центров ферментов, катализирующих разные реакции, различно. Структура активного центра фермента комплементарна структуре его субстрата, вследствие чего данный фермент из множества веществ, имеющихся в живой клетке, присоединяет только свой субстрат. Эту особенность называют субстратной специфичностью фермента. Например, структура активного центра фермента гистидазы комплементарна структуре аминокислоты гистидина, поэтому возможно образование фермент-субстратного комплекса гистидаза—гистидин; другие вещества, в том числе аминокислоты, не связываются гистидазой.
Кроме того, часть функциональных групп активного центра ферментов имеет такое строение и реакционную способность, что обеспечивается химическое превращение субстрата в новые вещества — продукты ферментативной реакции. Каждый фермент катализирует не любое из всех возможных химических превращений субстрата, а какое-либо одно. Назовем это свойство специфичностью пути превращения.Жиры — это группа соединений, отдельные представители которых различаются природой жирно-кислотных остатков (радикалов R). Липаза расщепляет жиры, включающие разные жирно-кислотные остатки. Другой пример групповой специфичности — действие ферментов, гидролизующих пептиды и белки: многие из этих ферментов расщепляют пептидные связи, образованные разными аминокислотами.
Пространственная структура стереоизомеров вещества различна, поэтому активный центр фермента, комплементарный одному стереоизомеру, не обязательно будет комплементарен и другим стереоизомерам. В связи с этим многие ферменты катализируют превращение лишь одного из стереоизомеров — стереоспецифич-ность. Например, малеиновая кислота, являющаяся г^оизомером фумаровой кислоты (рис. 2.3), не может быть субстратом фумаразы.
Многие ферменты для проявления каталитической активности нуждаются в присутствии некоторых веществ непептидной природы — кофакторов. Различают две группы кофакторов: ионы металлов (а также некоторые неорганические анионы) и коферменты, которые представляют собой органические вещества.Примерно треть всех известных ферментов содержит ион металла или активируется ионами металла. Прочность связи металлов с белковой частью фермента колеблется в широких пределах. Некоторые ферменты в процессе их выделения утрачивают ион металла вследствие диссоциации, так что при измерении активности фермента приходится эти ионы добавлять — это ферменты, активируемые металлами. Другие ферменты сохраняют ион металла при очистке — это металло-ферменты (металлопротеины). Деление на эти группы условно, поскольку между крайними формами существует ряд промежуточных форм.
В роли кофактора могут выступать ионы различных металлов (табл. 2.1). Ион металла может участвовать в присоединении субстрата, собственно в катализе, в стабилизации оптимальной конформации молекулы фермента, в стабилизации четвертичной структуры. Активность металлозависимых ферментов после удаления металла либо утрачивается полностью, либо заметно снижается.Коферменты — это органические вещества, как правило, неаминокислотной природы, непосредственно участвующие в катализе в составе фермента.
Ингибиторами ферментов называют вещества, снижающие их активность. Наибольший интерес представляют ингибиторы, взаимодействующие с активным центром фермента. Такие ингибиторы чаще всего являются структурными аналогами субстрата и, следовательно, комплементарны активному центру фермента. Поэтому они подавляют активность только одного фермента или группы ферментов с очень сходным устройством активного центра. Различают ингибиторы конкурентные и неконкурентные, обратимые и необратимые.
Малоновая кислота НООС—СН2—СООН является структурным аналогом янтарной кислоты, поэтому она может присоединяться к активному центру сукци-натдегидрогеназы (см. выше). Но дегидрирование малоновой кислоты невозможно. Если в реакционной смеси имеются одновременно и янтарная, и малоновая кислоты, то происходят следующие процессы:Некоторые молекулы фермента оказываются занятыми ингибитором (I) и не участвуют в реакции превращения субстрата: следовательно, скорость образования продукта снижается. Если повышать концентрацию субстрата, то доля комплекса ES увеличивается, а комплекса EI уменьшается: субстрат и ингибитор конкурируют за активный центр фермента. Это пример конкурентного ингибирования. При достаточно высокой концентрации субстрата весь фермент будет в форме комплекса ES и скорость реакции будет максимальной, несмотря на присутствие ингибитора.
Некоторые ингибиторы образуют комплекс не со свободным ферментом, а с фермент-субстратным комплексом:В этом случае повышение концентрации субстрата не уменьшает действие ингибитора; такие ингибиторы называются неконкурентными.
В некоторых случаях ингибитор может подвергаться химическому превращению под действием фермента. Например, тг-нитрофени л ацетат гидролизуется протеолитическим ферментом химотрипсином; гидролиз происходит в две стадии.
Метаболизмом называют химические превращения веществ в организме (от греч. metabole — изменение, превращение). Вещества, участвующие в метаболизме, называют метаболитами. Метаболизм — результат действия ферментов: все реакции, определяющие баланс веществ в живой клетке, катализируются ферментами.
В живой клетке имеются многие тысячи разных веществ. Каждое из них в принципе может реагировать со многими другими. Однако фактически каждое вещество участвует в немногих реакциях, часто только в одной. Например, в мышечных клетках практически вся глюкоза реагирует только с АТФ, превращаясь в глюкозо-6-фосфат. Это происходит потому, что в этих клетках есть фермент, катализирующий реакцию образования глюкозо-6-фосфата; ферментов, которые катализировали бы другие в принципе возможные реакции глюкозы, в мышцах нет, а некатализируемые реакции протекают настолько медленно, что практически не оказывают влияния на баланс глюкозы. Глюкозо-6-фосфат затем превращается в другой метаболит, тоже при участии специального фермента, и т. д. Таким образом, получается определенная последовательность реакций и метаболитов — метаболический путь глюкозы. Каждый метаболит образуется из предшественника при участии специфического фермента и, в свою очередь, служит субстратом для следующего фермента. Аналогично и другие вещества превращаются по характерным для них метаболическим путям. Метаболические пути всех веществ связаны друг с другом общими метаболитами, образуя единую сетку реакций.Таким образом, ферментативный катализ в живой клетке служит инструментом отбора определенных реакций из множества возможных. В ходе биологической эволюции возник набор ферментов, катализирующих лишь те реакции, которые оказались полезными для живой системы. В результате в организме существует не хаос реакций, а определенная система реакций — метаболизм.
Говоря о метаболизме, чаще всего имеют в виду превращения низкомолекулярных веществ, и метаболитами обычно называют низкомолекулярные вещества. Однако многие ферменты катализируют химические изменения (модификацию) высокомолекулярных соединений: удаление части мономеров, добавление новых мономеров, присоединение других веществ, например присоединение фосфорной кислоты к белкам при образовании фосфопротеина или присоединение углеводов при образовании гликопротеинов, и т. п. В результате таких перестроек изменяются функциональные свойства полимеров, поэтому многие реакции модификации полимеров играют важную роль в регуляции метаболизма.
Промежуточное место между метаболизмом низкомолекулярных соединений и реакциями модификации макромолекул занимают реакции синтеза полимеров, в том числе белков и самих ферментов, а также реакции распада полимеров на мономеры в тканях и распада полимерных веществ пищи в желудочно-кишечном тракте. Число ферментов, естественными субстратами которых являются полимеры, превышает число ферментов, действующих на низкомолекулярные субстраты.
История изучения строения, биосинтеза и функций ДНК связана с возникновением и решением общебиологической проблемы наследственности.
На рубеже XIX и XX вв. генетические и цитологические исследования привели к выводу, что ответственными за передачу признаков по наследству являются хромосомы. При этом можно выделить некоторый наследственный признак, который передается с определенным участком хромосомы — геном. Всему набору признаков организма соответствует набор генов всех хромосом — генотип. Объяснение механизма передачи признаков включало представление о самовоспроизведении (репликации) генотипа; в результате самовоспроизведения генотип клетки удваивается, и при последующем делении дочерние клетки получают по полному набору генов. Это представление обосновывалось картиной удвоения и расхождения хромосом в процессе митоза.
Поскольку хромосомы содержат белок и ДНК, возник вопрос, какое из этих веществ участвует в передаче наследственных признаков. В 40-50-е годы XX в. появилось много экспериментальных указаний на то, что передача наследственной информации осуществляется молекулами ДНК. Одним из наглядных доказательств этого послужило изучение размножения бактериофагов — вирусов, паразитирующих на бактериях. Бактериофаг Т4, размножающийся в клетках кишечной палочки, состоит из ДНК и белковой оболочки с довольно сложной морфологией (рис. 4.2). Фаг имеет головку икосаэдрической формы, в которой тесно упакована одна молекула ДНК, и полый цилиндрический хвост, от конца которого отходят шесть тонких нитей. Хвост имеет двойные стенки и представляет собой как бы трубку, вставленную в трубку большего диаметра.Процесс заражения бактерии фагом представляет собой сложную последовательность молекулярных событий. Фаг присоединяется к ее поверхности с помощью хвостовых нитей, и конец хвоста фиксируется на оболочке бактерии. Прикрепление фага к бактерии основано на комплементарном взаимодействии белков хвостовых нитей и конца хвоста с веществами бактериальной стенки. Затем наружная трубка хвоста сокращается, внутренняя трубка проникает через оболочку бактерии, и через нее из головки внутрь бактерии «впрыскивается» ДНК фага, тогда как белковая оболочка фага остается на поверхности. Через некоторое время, измеряемое десятками минут, в бактерии обнаруживается уже несколько сот фаговых частиц, имеющих и белковую оболочку, и ДНК внутри нее. Из этого следует, что вся информация о структуре фага содержится в его ДНК.
Такого рода работами завершилась линия исследований, посвященных выяснению материальной основы наследственности; начало этой линии восходит к первым наблюдениям и осознанию явления наследственности, роль которой стала вполне ясной после появления теории биологической эволюции.
После установления химической природы наследственного материала проблема самовоспроизведения (репликации) хромосом, а точнее — генотипа превратилась в проблему репликации ДНК. Первостепенное значение для решения этой проблемы имела разработка модели строения ДНК Ф. Криком и Дж. Уотсоном в 1953 г. Структура двойной спирали позволяла представить простой механизм репликации ДНК: двойная спираль сначала раскручивается, цепи расходятся, а затем каждая одноцепочечная половина молекулы ДНК достраивается до целой, двухцепо-чечной молекулы:Последовательность нуклеотидов вновь синтезирующихся цепей определяется правилом комплементарности оснований и последовательностью нуклеотидов имеющейся цепи. Иначе говоря, имеющиеся нуклеотидные цепи служат матрицей для синтеза новых цепей; в результате получаются две двухцепочечные молекулы ДНК, идентичные исходной молекуле.
Такой способ репликации получил название полуконсервативного (в принципе возможен и другой механизм — консервативный, при котором вновь синтезируемая нуклеотидная цепь образуется прямо на двойной спирали ДНК, без ее раскручивания). Полуконсервативный механизм репликации ДНК нашел подтверждение в экспериментах с клетками кишечной палочки. Культуру Е. coli на протяжении нескольких поколений выращивали на среде, содержащей в качестве единственного источника азота 15NH4C1. После этого все вещества клеток Е. coli, в которые входит азот, содержали не обычный изотоп азота 14N, а тяжелый 15N. ДНК с 15N имеет большую плотность, чем ДНК с 14N, и это можно обнаружить методом центрифугирования (рис. 4.3). Если культуру, содержащую 151Ч-ДНК, пересеять на среду с немеченым азотом (14NH4C1), то ДНК клеток первого поколения имеет плотность, промежуточную между плотностями 15№ДНК и 14№ДНК; в клетках второго поколения обнаруживается два типа ДНК: с промежуточной плотностью и легкая (141Ч-ДНК). Эти результаты легко объясняются, если исходить из полуконсервативного механизма репликации ДНК (см. рис. 4.3). Позднее было установлено, что в клетках эукариот репликация ДНК происходит также полуконсервативным способом.
Механизмы регуляции транскрипции у бактерий изучены достаточно хорошо. Эти примеры важны и для изучения биохимии животных, поскольку дают представление об общих молекулярных основах регуляции действия генов.
Рассмотрим пример индукции синтеза белков. Кишечная палочка в качестве пищевого вещества может использовать дисахарид лактозу. Превращения лактозы в клетках Е. coli начинаются с гидролиза при участии (З-галактозидазы (лактазы):При выращивании Е. coli на среде без лактозы р-галактозидаза в клетках обнаруживается в очень малых количествах. Если же в среду добавить лактозу, количество фермента увеличивается в сотни раз за несколько минут, т. е. происходит индукция синтеза фермента.
Изучение молекулярных механизмов этого явления привело к созданию теории оперона. Опероном называют отрезок ДНК, содержащий структурные гены определенных белков и регуляторные участки. На рис. 4.22 приведена схема лак-тозного оперона.С участком оперона, называемым промотор, связывается РНК-полимераза. При ее движении по оперону происходит транскрипция структурных генов (3-га-лактозидазы, пермеазы, необходимой для транспорта лактозы в клетку, и галакто-зидтрансацетилазы. При этом получается одна молекула мРНК, содержащая матрицы для всех трех белков. Последующая трансляция этой мРНК ведет к образованию указанных белков.
В результате транскрипции гена-регулятора образуется мРНК, служащая матрицей для синтеза белка-регулятора. Этот белок может присоединяться к оператору и тем самым блокировать транскрипцию структурных генов. Белок-регулятор может также соединяться с лактозой, при этом утрачивается его сродство к оператору.
Если в среде есть лактоза, то белок-регулятор связан с ней, оператор свободен и возможна транскрипция — синтезируются белки, необходимые для усвоения лактозы. Если лактозы в среде нет, то белок-регулятор соединяется с оператором, транскрипции нет и белки, ненужные в этих условиях, не синтезируются. Биологическая целесообразность такой регуляции очевидна: достигается экономия веществ и энергии.
Обязательным условием этого механизма регуляции является нестабильность мРНК: после исчерпания лактозы в среде мРНК должна быть быстро разрушена, чтобы прекратился синтез ставших ненужными белков. Это происходит путем гидролиза мРНК под действием РНКаз. Время полужизни мРНК в клетках бактерий измеряется немногими минутами.Примером регуляции путем репрессии синтеза может служить гистидиновый оперон бактерий Salmonella typhimurium. Этот оперон содержит 10 структурных генов, кодирующих 10 ферментов, необходимых для синтеза гистидина. Ферменты образуются только в том случае, когда в среде нет готового гистидина и клетки вынуждены сами синтезировать его из других веществ; добавление гистидина в среду прекращает синтез ферментов. Несмотря на противоположный результат индукции и репрессии синтеза белков, их молекулярные механизмы очень сходны. В действии гистидинового оперона легко разобраться, если на рис. 4.22 вместо «в присутствии лактозы» поставить «в отсутствие гистидина», вместо «в отсутствие лактозы» — «в присутствии гистидина» и вместо 3 структурных генов лак-тозного оперона — 10 структурных генов, кодирующих ферменты для синтеза гистидина.
В геноме человека имеется около 50 000 белковых генов. На протяжении жизненного цикла человека, от гамет до завершения жизненного пути, все они используются, экспрессируются, но не все одновременно, а в определенном порядке и по-разному в разных типах клеток. Многоклеточные организмы построены из дифференцированных клеток, специализированных для выполнения определенных функций. В организме человека различают сотни типов дифференцированных клеток, идентичных генотипически, но различающихся фенотипически. Фенотип клетки определяется набором белков, синтезирующихся в ней: белки можно рассматривать как первичные фенотипические признаки. В дифференцированной клетке экспрессируется 5 000-15 000 генов (белков), а все остальные гены «молчат». Основная часть белков дифференцированной клетки — это белки «домашнего хозяйства», т. е. те, которые обеспечивают само существование живой клетки. К ним относятся белки, участвующие в матричных синтезах, в синтезе АТФ, мембран и др. Белки «домашнего хозяйства» составляют около 80 % всех белков дифференцированной клетки. Меньшая часть приходится на белки, не обязательные для жизнеобеспечения самой клетки, но выполняющие в организме (не в отдельной клетке!) интегральные функции. Например, альбумин, синтезируемый и секретируемый гепатоцитами, пищеварительные ферменты, белки-гормоны, гемоглобин и др. Отметим, что «молчащих» генов в дифференцированной клетке существенно больше, чем действующих.
Таким образом, можно выделить два типа регуляции действия генов в клетках животных.
1. В дифференцированной клетке большая часть генов — около 80 % — полностью выключена, репрессирована, и это состояние сохраняется длительно, часто на протяжении всей жизни клетки или даже многих генераций клетки.
2. Интенсивность действия невыключенных генов регулируется путем индукции или репрессии. Сигналом для увеличения или уменьшения скорости синтеза белков служит изменение концентрации определенного вещества — гормона, некоторых метаболитов и др. Такие изменения обычно непродолжительны, и клетка возвращается в базальное состояние после прекращения действия сигнала.
Набор действующих и выключенных генов различен в дифференцированных клетках разных типов; различия возникают в ходе клеточной дифференцировки и определяют фенотип клетки. Молекулярные механизмы регуляции такого типа пока неизвестны. Изучение биохимии клеточной дифференцировки составляет одно из основных направлений современной биохимии; оно имеет важное значение для медицины, поскольку может открыть средства управления процессами регенерации поврежденных или даже утраченных органов.