Молекулярная масса
Один из распространенных методов определения молекулярной массы белков и других высокомолекулярных веществ основан на измерении скорости седиментации (осаждения) веществ при ультрацентрифугировании. Во вращающемся роторе ультрацентрифуги центробежное ускорение достигает 100 000-500 000 g (g — ускорение свободного падения). На поверхность буферного раствора, налитого в кювету ультрацентрифуги, наносят тонкий слой раствора белка и кювету помещают в ротор.
- Молекулярные массы.
При вращении ротора молекулы белка, более плотные, чем растворитель, начинают перемещаться в направлении от оси вращения. Положение белковой зоны в кювете в ходе центрифугирования регистрируется специальной оптической системой по показателю преломления, который больше в зоне белка, чем в буферном растворе.Коэффициент седиментации большинства белков лежит в пределах 1-20 S, но может достигать и 200 S.
Молекулярная масса белка пропорциональна его коэффициенту седиментации, коэффициенту диффузии и плотности. Измерив в независимых опытах коэффициент диффузии и плотность, можно вычислить молекулярную массу. Поскольку наибольшие трудности вызывает измерение коэффициента диффузии, нередко ограничиваются указанием только коэффициента седиментации белка, а также и других высокомолекулярных веществ и частиц (208-белок, бОБ-частица, 18S-PHK и т. д.). Эти величины позволяют оценить относительные размеры молекул и частиц, однако надо учитывать, что зависимость коэффициента седиментации от молекулярной массы нелинейная.
Более просто молекулярную массу белка можно определить методом гель-фильтрации, или молекулярного просеивания. Этот метод основан на применении специальных полимерных веществ, набухшие зерна (гранулы) которых имеют поры определенного размера. Часто используют сефадекс, гранулы которого построены из трехмерной сети полисахаридных цепей декстрана. Небольшие молекулы растворенных веществ легко диффундируют внутрь зерен сефадекса, в то время как диффузия крупных молекул затруднена. Это явление лежит в основе разделения веществ (молекулярного просеивания) методом гель-фильтрации.
Гелеобразную массу набухшего сефадекса помещают в стеклянную трубку (колонку), на поверхность геля наносят слой белкового раствора и затем через колонку пропускают буферный раствор (рис. 1.27). Белковый раствор вместе с буфером перемещается вдоль колонки между гранулами сефадекса. В результате диффузии молекулы белков могут проникать внутрь гранул и какое-то время удерживаться там. Поэтому белки проходят через колонку медленнее, чем буферный раствор, причем тем медленнее, чем меньше их молекулярная масса, так как молекулы белков с меньшей молекулярной массой легче диффундируют внутрь гранул.