Электрофорез в полиакриламидном геле
Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях — еще один метод фракционирования белков по различиям молекулярной массы. Скорость миграции белка в электрическом поле зависит не только от его суммарного заряда, но также и от величины и формы белковой молекулы.
- Электрофорез.
Для электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях в анализируемую смесь белков добавляют додецилсульфат натрия (ДДС-Na, C]2H25OS03Na), который представляет собой детергент с выраженными амфифильными свойствами. При этом олиго-мерные белки распадаются на протомеры, протомеры денатурируются и денатурированные пептидные цепи образуют мицеллы с ДДС-Na, содержащие примерно вдвое больше белка, чем ДДС-Na. Эти мицеллы имеют отрицательный заряд, обусловленный почти полностью ионами ДДС (C12H25OSO~3). Суммарный заряд мицеллы пропорционален содержанию в ней ДДС-Na, а содержание ДДС-Na пропорционально размеру пептидной цепи. Таким образом, в этом случае белки (точнее — пептидные цепи) разделяются не по их заряду (поскольку заряд мицелл определяется почти полностью ДДС-Na), а по молекулярной массе пептидных цепей (рис. 1.34).
Различия по специфичности к лигандам используются в методе, который называется аффинной хроматографией или хроматографией по сродству. В этом варианте хроматографии в качестве сорбента применяют инертный полимер с присоединенным к нему специфическим лигандом того белка, который хотят выделить. Суть метода и пример применения представлены на рис. 1.35 и 1.36.
Через колонку сорбента пропускают раствор белков (см. рис. 1.35); с сорбентом связывается только тот белок, активный центр которого комплементарен лиганду (а); другие белки удаляют промыванием колонки. Затем через колонку пропускают раствор с высокой концентрацией свободного лиганда; в этих условиях образуется свободный комплекс белка с лигандом (б), который элюируется с колонки.Выделение индивидуального белка требует последовательного применения многих приемов (см. рис. 1.37 и табл. 1.9). Ход выделения контролируют по увеличению содержания выделяемого белка в препарате после каждой стадии. Концентрацию выделяемого белка в препаратах сравнивают по способности этих препаратов связывать специфический лиганд (функциональная активность), как это описано выше. Активность выражают в условных единицах, например в единицах поглощения света (оптической плотности), и рассчитывают на 1 мл препарата.