Рубрика ‘Биологическая химия’
По форме молекулы и особенностям пространственной структуры белки делятся на две группы: глобулярные и фибриллярные. Форма глобулярных белков близка к сферической или эллипсоидной, с отношением короткой и длинной осей до 1:50. Молекулы фибриллярных белков имеют удлиненную форму и могут образовывать многомолекулярные нитевидные агрегаты — фибриллы. Фибриллярные белки выполняют главным образом опорные функции, обеспечивая прочность тканей; глобулярные белки несравненно более разнообразны по функциям. Существенны различия белков этих групп и по физико-химическим свойствам. Особенности строения и свойств фибриллярных белков подробнее описаны в одном из последующих разделов этой главы.
Третичная структура глобулярных белков образуется путем дополнительного складывания пептидной цепи, содержащей а-спирали, (3-структуры и участки без периодической структуры. Это происходит прежде всего в результате взаимодействий между боковыми группами аминокислот.Дисульфидная связь возникает за счет сульфгидрильных (тиоловых) групп цисте-ина. Соединение, получающееся в результате замыкания дисульфидной связи между двумя молекулами свободного цистеина, называют цистином:Цистеиновые остатки пептидных цепей, связанные дисульфидной связью, называют полуцистиновыми остатками.
Образование дисульфидных связей приводит к тому, что удаленные друг от друга области пептида сближаются и фиксируются. Например, в молекуле рибо-нуклеазы имеется четыре дисульфидных связи, соединяющих попарно восемь по-луцистиновых остатков так, что образуются фиксированные петли
Основную роль в образовании третичной структуры играют нековалентные взаимодействия между радикалами аминокислот — водородные, ионные, гидрофобные связи. Аминокислоты, входящие в белки, различаются по физико-химическим свойствам радикалов. Между аминокислотами с неполярными (гидрофобными) радикалами возможны гидрофобные взаимодействия; между полярными радикалами возникают водородные связи, а между заряженными полярными радикалами — ионные (рис. 1.16). Все эти связи относятся к числу слабых: их энергия в водной среде не слишком сильно превышает энергию теплового движения молекул при комнатной температуре, и поэтому их образование и разрушение — легкообратимые процессы.В результате возникновения множества слабых связей между аминокислотными остатками все части пептидной цепи оказываются фиксированными относительно друг друга, образуя компактную структуру — глобулу. При этом а-спирали и (3-структуры располагаются преимущественно внутри глобулы, а (3-поворот и участки без периодической структуры — на поверхности глобулы.Значительная часть неполярных (гидрофобных) аминокислот оказывается погруженной во внутренние области глобулы, в то время как полярные (гидрофильные) аминокислоты располагаются преимущественно на поверхности глобулы, контактируя с водной фазой Такое распределение аминокислот объясняется в основном свойствами воды. Молекулы воды полярны и образуют водородные связи как между собой, так и с другими полярными молекулами (гидратация молекул). Неполярные молекулы не гидратируются. С другой стороны, внедрение неполярной молекулы в среду молекул воды требует разрыва водородных связей между молекулами воды. Поэтому возникают силы, стремящиеся уменьшить поверхность раздела между водной и неполярной фазой, что и приводит к объединению неполярных молекул между собой, а в случае белков — к «выжиманию» гидрофобных радикалов из водной среды внутрь глобулы.
Доля погруженных цистеиновых остатков тоже велика, хотя они и гидрофильны; это обусловлено тем, что многие из них участвуют в образовании дисульфидных связей.
Длинные полипептидные цепи (длиной около 200 аминокислотных остатков или больше) обычно имеют доменную пространственную структуру. Доменом называют часть пептидной цепи, образующей как бы самостоятельную глобулу, причем на одной пептидной цепи может быть два или больше доменов. Домены в одном белке могут быть одинаковыми или различными как по структуре, так и по функции. Часто домен по своей структуре и свойствам сходен с отдельным глобулярным белком. На рис. 1.17, #представлена молекула, в которой два крупных, четко различимых домена.Нередко в белках, различающихся по структуре и функции, встречаются однотипные сочетания а- и (3-структур (структурные мотивы), обозначаемые как супервторичная структура. На рис. 1.18, а представлен домен молекулы фермента пируват-киназы, имеющий супервторичную структуру типа бочонка (она есть и в некоторых других белках). В этом домене 8 а-спиральных участков образуют «бочонок», внутри которого находятся 8 (3-структурных участков. Многие ферменты содержат домен, в центре которого расположены (3-структурные участки в виде скрученного листа, и а-спирали, расположенные по периферии домена (рис. 1.18, б). Характерные супервторичные структуры имеются в белках, связывающихся с ДНК (см. гл. 4).Белковая глобула не является абсолютно жесткой структурой: в известных пределах возможны обратимые перемещения частей пептидной цепи относительно друг друга с разрывом небольшого числа слабых связей и образованием новых. Молекула в растворе как бы пульсирует в разных своих частях. Эти изменения можно рассматривать как тепловое (броуновское) движение отдельных участков пептидной цепи. Они не нарушают основного плана конформации молекулы,подобно тому, как тепловые колебания атомов в кристалле не изменяют структуру кристалла, если температура не настолько велика, что наступает плавление.
Небольшие изменения конформации белковых молекул происходят и при взаимодействии их с другими молекулами. Например, конформация гемоглобина с присоединенным к нему кислородом немного отличается от конформации гемоглобина в отсутствие кислорода.
При разрыве большого числа связей, стабилизирующих пространственную структуру белковой молекулы, упорядоченная, уникальная для каждого белка конформация пептидной цепи нарушается, и молекула целиком или в значительной части принимает форму случайного беспорядочного клубка (случайного в том смысле, что каждая молекула данного индивидуального белка по конформации может отличаться от всех других молекул).
Такое изменение белка называют денатурацией (рис. 1.20). Денатурацию можно вызвать нагреванием до 60-80 °С или действием других агентов, разрушающих нековалентные связи в белках. Денатурация происходит на поверхности раздела фаз, в кислых или, наоборот, щелочных средах, при действии ряда органических соединений — спиртов, фенолов и др.; часто для денатурации применяют мочевину или гуанидинхло-рид. Эти вещества образуют слабые связи (водородные, ионные, гидрофобные) с аминогруппами или карбонильными группами пептидного остова и с некоторыми группами радикалов аминокислот, подменяя собственные внутримолекулярные водородные связи в белке, вследствие чего вторичная и третичная структуры изменяются.Устойчивость к денатурирующим агентам в большой мере зависит от наличия дисульфидных связей в молекуле белка. В ингибиторе трипсина (панкреатический белок) есть три S — S-связи. Если их восстановить, то происходит денатурация без других денатурирующих воздействий. Если затем белок поместить в окислительные условия, в которых происходит окисление SH-групп цистеина и образование дисульфидных связей, то исходная конформация восстанавливается. Даже единственная дисульфидная связь существенно повышает стабильность пространственной структуры.
Денатурация обычно сопровождается снижением растворимости белка; при этом часто образуется осадок «свернувшегося белка», а если концентрация белков в растворе достаточно велика, то «свертывается» вся масса раствора, как это происходит при варке куриного яйца. При денатурации утрачивается биологическая активность белков. На этом основано применение водного раствора фенола (карболовая кислота) в качестве антисептика.
Лабильность пространственной структуры белков и большая вероятность их денатурации при разнообразных воздействиях создают значительные затруднения при выделении и изучении белков, а также при их использовании в медицине и промышленности.
В определенных условиях при медленном охлаждении раствора денатурированного нагреванием белка происходит ренативация — восстановление исходной (нативной) конформации (см. рис. 1.20, 4). Это подтверждает, что характер укладки пептидной цепи определяется первичной структурой белка. Процесс образования нативной конформации белка самопроизвольный, т. е. эта конформация отвечает минимуму свободной энергии молекулы. Можно сказать, что пространственная структура белка закодирована в аминокислотной последовательности пептидных цепей. Это означает, что все идентичные по чередованию аминокислот полипептиды (например, пептидные цепи миоглобина) будут принимать идентичную же конформацию. Однако из этого правила есть исключения. Капсид (оболочка) вируса кустистости томатов содержит белок, построенный из субъединиц А, В и С; первичная структура этих субъединиц идентична, а конформация различна. Известны идентичные олигопептидные последовательности (около 5 аминокислотных остатков), которые в одних белках образуют а-спирали, в других — р-структуры. Таким образом, нативная конформация каждого участка пептидной цепи зависит не только от его первичной структуры, но и от ближайшего окружения.
Белки, имеющие одинаковую или почти одинаковую конформацию, могут существенно различаться по первичной структуре. Например, миоглобин, а-прото-меры и [3-протомеры гемоглобина имеют почти одинаковую конформацию (см. рис. 1.9), но их первичная структура заметно различается: примерно в 70 % позиций аминокислоты не совпадают. Однако в таких случаях несовпадающие аминокислоты, как правило, сходны по физико-химическим свойствам боковых цепей.
Денатурация белков с небольшой скоростью происходит и в живой клетке. Ренативация денатурированных белков в условиях клетки затруднена вследствие высокой концентрации белков: денатурированные молекулы обнажившимися гидрофобными участками соединяются с другими молекулами, что препятствует правильной укладке пептидной цепи. Однако существуют специальные белки — шапероны, помогающие восстановить натив-ную структуру частично денатурированных белков. Шапероны называют также белками теплового шока, поскольку их синтез в клетке увеличивается при повышенной температуре. Это большая группа белков, сходных по структуре и функциям. Известны три семейства шаперонов: шапероны-60, -70 и -90 (число — молекулярная масса белка в кДа). Шапероны-60 образуют шаперониновый комплекс, имеющий форму двух бочонков, соединенных днищами. Стенки бочонков образуют 14 молекул шаперона-60 (рис. 1.21).
На поверхности молекул, обращенной внутрь кольца, имеются участки, обогащенные гидрофобными радикалами аминокислот. К этим участкам могут присоединяться частично денатурированные белки цитозоля с открытыми гидрофобными последовательностями. Таким образом поврежденный белок оказывается в полости шаперонинового комплекса, где нет других молекул цитозоля, мешающих ренативации. Путем перебора разных вариантов создается термодинамически выгодная конформация, и ренативированный белок выходит в цитозоль. Однако следует отметить, что значительная часть денатурированных белков гидролизу ет-ся клеточными ферментами.
Шапероны выполняют также ряд других функций, в том числе участвуют в формировании пространственной структуры белков при их синтезе. Эти функции будут рассмотрены в соответствующих разделах.
Многие белки построены из двух или более пептидных цепей, соединенных неко-валентными связями. Такие белки могут распадаться на составляющие их пептидные цепи при сравнительно небольших изменениях среды, например при подкис-лении, подщелачивании, добавлении гидрофобных веществ, охлаждении, а также при действии денатурирующих агентов. Примером может служить основной белок эритроцитов — гемоглобин (НЬ). Он построен из четырех пептидных цепей — две цепи а и две цепи (3. Строение тетрамерного НЬ представляют формулой 2а2(3. При указанных выше воздействиях тетрамерный гемоглобин диссоциирует сначала на димеры, а затем и на мономеры (протомеры):Могут образоваться также димеры оса и pp. Димеры и протомеры называют субъединицами белка; протомеры — это наименьшие субъединицы. Если из раствора удалить агент, вызвавший диссоциацию, субъединицы вновь объединяются в тетрамерную молекулу, т. е. происходит самосборка молекул гемоглобина.
Белки, молекулы которых, подобно гемоглобину, построены из нескольких полипептидных цепей (по существу, из нескольких белков меньшего размера), называют олигомерными белками. Количество протомеров, способ их соединения и пространственной укладки относительно друг друга называют четвертичной структурой белка.
Белки с молекулярной массой больше 50 ООО почти всегда являются олигомерными. Число протомеров в олигомерных белках чаще всего лежит в пределах десяти, но может быть и гораздо большим; наиболее часто встречаются димеры и тетрамеры. Протомеры могут быть как идентичными, так и разными (табл. 1.6). Равновесие диссоциации некоторых олигомерных белков в условиях клетки таково, что в клетке существуют олигомер и его субъединицы в сравнимых количествах. Четвертичная структура является такой же специфичной, уникальной характеристикой данного белка, как и другие уровни структуры.
Протомеры соединяются в результате образования гидрофобных, ионных, водородных связей. При этом протомеры взаимодействуют друг с другом не любой частью своей поверхности, а определенным участком (контактная поверхность). Между каждой парой взаимодействующих контактных участков образуются десятки связей.
Процесс самосборки отличается высокой специфичностью. Если в растворе наряду с протомерами гемоглобина есть и протомеры других белков, они не образуют соединений с протомерами гемоглобина. Протомеры данного белка «находят» и «узнают» друг друга, соединяясь только друг с другом. Взаимное узнавание протомеров обусловлено особой структурой контактных поверхностей. Контактные поверхности содержат много гидрофобных аминокислотных остатков, которые при объединении протомеров образуют гидрофобное ядро олигомерного белка. При этом расположение групп, образующих связи, на одном протомере соответствует их расположению на другом протомере Если на одной поверхности имеется выступ, то на другой в соответствующем месте — углубление, в которое при контакте входит выступ; соответственно, при контакте оказываются совпадающими разноименно заряженные ионные группы или группы, способные образовать водородные связи, или гидрофобные участки поверхностей. Такого рода поверхности называют комплементарными; они подходят друг к другу, как ключ к замку Каждый протомер взаимодействует с другим в десятках точек; это означает, что ошибочное соединение (неправильная ориентация в олигомере или соединение с другими белками) практически невозможно.
Комплементарные взаимодействия молекул (не только белковых) лежат в основе всех биохимических процессов в организме.
Олигомерные белки в строгом смысле нельзя назвать молекулами: скорее это надмолекулярные структуры, занимающие промежуточное положение между молекулами и клеточными органеллами, такими, как шаперониновый комплекс, рибосомы, хромосомы, мембраны и др. Таким образом, здесь намечается путь к пониманию того, как на основе химических и физико-химических свойств возникают структуры и свойства, характерные для биологической формы движения материи.
Рассмотрим в качестве примера самосборки клеточных органелл простую структуру — микротрубочки. Эти органеллы представляют собой длинные полые цилиндры с наружным диаметром 24 нм и внутренним — 15 нм; толщина их стенок 5 нм. Длина микротрубочек в большинстве клеток составляет несколько микрометров, однако в аксонах нервных клеток она достигает нескольких сантиметров. Микротрубочки имеются во всех клетках, причем постоянно обновляются: то распадаются, то вновь образуются. Они участвуют в образовании цитоскелета и поддержании формы клетки, во внутриклеточном транспорте веществ, в движении хромосом при делении клетки (митотическое веретено состоит в основном из микротрубочек), в перемещении частей клеточных мембран.
Микротрубочки построены из белка тубулина; это димерный белок, состоящий из двух разных протомеров, с молекулярной массой 111 500. Тубулин сравнительно легко удается выделить из некоторых тканей в чистом виде. Если в раствор тубулина добавить соль магния (ионы Mg2+), то начинается образование микротрубочек (рис. 1.23). Трубочка удлиняется в результате присоединения димеров к торцам; каждое кольцо трубочки содержит 13 протомеров, а порядок присоединения определяется наличием соответствующих контактных участков.
Олигомерные белки обладают особыми свойствами, которых нету белков, не имеющих четвертичной структуры. Это можно увидеть, сравнивая белок мышц ми-оглобин и белок эритроцитов гемоглобин. Вторичная и третичная структуры ми-оглобина и протомеров гемоглобина очень сходны (ср. рис. 1.9 и 1.22). Оба эти белка являются гемопротеинами и выполняют в организме сходные функции, в основе которых лежит способность обратимо связывать кислород. Простетическая группа этих белков — гем — представляет собой плоскую молекулу, содержащую четыре пиррольных цикла и соединенный с ними атом железа (рис. 1.24).
Пептидная цепь миоглобина содержит 153 аминокислотных остатка. Из них примерно три четверти образуют восемь
ос-спиральных участков, обозначаемых латинскими буквами от А до Н. Плоская молекула гема расположена в углублении между спиралями Е и F (рис. 1.25). Гем соединяется с белковой частью (глобином) гидрофобными связями между пирроль-ными циклами и гидрофобными радикалами аминокислот. Атом железа в молекуле гема образует шесть координационных связей: четыре с атомами азота пиррольных колец гема, одну с атомом азота имидазольного кольца гистидина, расположенного в спирали F (проксимальный гистидин), и еще одну — с молекулой 02. Спираль Е содержит также остаток гистидина, не связанный с гемом (дистальный гистидин), но способствующий присоединению кислорода к иону железа.
Пиррольные кольца гема расположены в одной плоскости, в то время как атом железа в дезоксигемоглобине несколько выступает из этой плоскости (на0,6 ангстрема). Присоединение кислорода «выпрямляет» молекулу гема: железо перемещается в плоскость пиррольных колец. Поскольку железо связано с остатком проксимального гистидина пептидной цепи, то происходит и перемещение участка пептидной цепи, разрыв некоторых слабых связей в молекуле белка, т. е. несколько изменяется конформация белка. Таким образом, присоединение кислорода сопровождается изменением пространственной структуры. В этом отношении миоглобин и гемоглобин одинаковы, но следствия изменения их конформации различны.
Один из распространенных методов определения молекулярной массы белков и других высокомолекулярных веществ основан на измерении скорости седиментации (осаждения) веществ при ультрацентрифугировании. Во вращающемся роторе ультрацентрифуги центробежное ускорение достигает 100 000-500 000 g (g — ускорение свободного падения). На поверхность буферного раствора, налитого в кювету ультрацентрифуги, наносят тонкий слой раствора белка и кювету помещают в ротор. При вращении ротора молекулы белка, более плотные, чем растворитель, начинают перемещаться в направлении от оси вращения. Положение белковой зоны в кювете в ходе центрифугирования регистрируется специальной оптической системой по показателю преломления, который больше в зоне белка, чем в буферном растворе.Коэффициент седиментации большинства белков лежит в пределах 1-20 S, но может достигать и 200 S.
Молекулярная масса белка пропорциональна его коэффициенту седиментации, коэффициенту диффузии и плотности. Измерив в независимых опытах коэффициент диффузии и плотность, можно вычислить молекулярную массу. Поскольку наибольшие трудности вызывает измерение коэффициента диффузии, нередко ограничиваются указанием только коэффициента седиментации белка, а также и других высокомолекулярных веществ и частиц (208-белок, бОБ-частица, 18S-PHK и т. д.). Эти величины позволяют оценить относительные размеры молекул и частиц, однако надо учитывать, что зависимость коэффициента седиментации от молекулярной массы нелинейная.
Более просто молекулярную массу белка можно определить методом гель-фильтрации, или молекулярного просеивания. Этот метод основан на применении специальных полимерных веществ, набухшие зерна (гранулы) которых имеют поры определенного размера. Часто используют сефадекс, гранулы которого построены из трехмерной сети полисахаридных цепей декстрана. Небольшие молекулы растворенных веществ легко диффундируют внутрь зерен сефадекса, в то время как диффузия крупных молекул затруднена. Это явление лежит в основе разделения веществ (молекулярного просеивания) методом гель-фильтрации.
Гелеобразную массу набухшего сефадекса помещают в стеклянную трубку (колонку), на поверхность геля наносят слой белкового раствора и затем через колонку пропускают буферный раствор (рис. 1.27). Белковый раствор вместе с буфером перемещается вдоль колонки между гранулами сефадекса. В результате диффузии молекулы белков могут проникать внутрь гранул и какое-то время удерживаться там. Поэтому белки проходят через колонку медленнее, чем буферный раствор, причем тем медленнее, чем меньше их молекулярная масса, так как молекулы белков с меньшей молекулярной массой легче диффундируют внутрь гранул.