Клонирование
Описанная выше процедура сложна и позволяет получать лишь очень небольшие количества рекомбинантной ДНК (рекомбинантных плазмид). Клонирование — это способ накопления, амплификации рекомбинантной ДНК.
- Клоны.
Если к культуре Е. coli добавить рекомбинантные плазмиды, то они при определенных условиях включаются в бактериальные клетки — получаются рекомбинантные бактерии (рис. 5.14). Плазмиды в клетке начинают реплицироваться. При размножении бактерий вновь образующиеся бактериальные клетки тоже содержат эти плазмиды. Из рекомбинантных бактерий можно выделить клонированные рекомбинантные плазмиды, а из них — исследуемый фрагмент ДНК: для этого рекомбинантные плазмиды обрабатывают той же рестриктазой, с помощью которой они были созданы (см. рис. 5.13). Таким путем можно выделить ген или любой другой фрагмент ДНК в количествах, достаточных для исследовательских целей. Отметим, что этот результат вполне подобен результату, получаемому при использовании ПЦР: и в том и в другом случае происходит накопление исследуемой ДНК; по этой причине ПЦР часто называют молекулярным клонированием ДНК.Микроорганизмы — очень удобный объект для промышленного получения многих природных продуктов: они быстро размножаются (биомасса может удваиваться всего за полчаса), процессы выращивания и обработки биомассы технологичны, поддаются автоматизации. С развитием генной инженерии и техники рекомбинантных микроорганизмов появилась возможность заставить микроорганизмы синтезировать нужные человеку вещества, которые получить другими методами сложно (см. рис. 5.14). Например, интерферон для применения в качестве лекарства прежде получали либо из лейкоцитов крови человека, либо из культуральной жидкости, в которой выращивают клетки человека, синтезирующие этот белок. Такие методы очень дороги и не позволяют получать достаточные количества лекарства.
Если ввести в клетки Е. coli плазмиду, содержащую ген интерферона человека, то они начинают продуцировать интерферон — белок, который природные штаммы бактерии не синтезируют. В настоящее время методами генной инженерии созданы также микроорганизмы, синтезирующие человеческие гормоны инсулин (рис. 5.15), соматостатин, соматотропин, фермент урокиназу, некоторые факторы свертывания крови и др. Все эти белки применяются для лечения болезней.