Процедура выделения какого-либо белка
Процедура выделения какого-либо белка начинается с переведения белков ткани в раствор. Для этого ткань измельчают и клетки разрушают с помощью специальных приборов — гомогенизаторов, или просто растиранием с песком. Нерастворимые части ткани из гомогената осаждают центрифугированием. В надосадочной жидкости (экстракте) содержатся растворимые белки.
- Процедура выделения белка.
Если выделяемый белок прочно связан с какими-либо клеточными структурами, его можно перевести в раствор, обрабатывая гомогенат детергентами. В экстракте наряду с веществами небелковой природы присутствует много разных белков, причем искомый белок часто содержится в очень небольших количествах, составляющих десятые доли процента от всех белков.
Главная трудность выделения индивидуального белка состоит именно в его отделении от остальных белков. Все белки как соединения одного класса обладают сходными свойствами, и их фракционирование основано на небольших различиях в свойствах разных белков. В процессе выделения по возможности избегают денатурирующих воздействий: работу проводят при температуре, близкой к 0 °С, не применяют сильнокислых или сильнощелочных растворов.
Избирательная денатурация. Многие белки денатурируются и выпадают в осадок при нагревании раствора до 50-70 °С или при подкислении примерно до рН 5. Если выделяемый белок выносит эти условия, то часть посторонних белков можно удалить из раствора таким способом.
Различия в растворимости. Чаще всего используют зависимость растворимости белков от концентрации сульфата аммония. Если в раствор белков добавить небольшое количество (NH4)2S04 (например, 10 г на 100 мл раствора), то наименее растворимые белки выпадут в осадок. Осадок отделяют центрифугированием, а к надосадочной жидкости добавляют еще 10 г (NH4)2S04 и получают второй осадок. Продолжая эту процедуру, получают ряд фракций; в одной из них содержание искомого белка больше, чем в других. Сходным образом можно фракционировать белки добавлением возрастающих количеств ацетона или спирта.
Различия в количестве и природе ионогенных групп. Эти свойства позволяют фракционировать белки методами ионообменной хроматографии и электрофореза.
Для хроматографии белков применяют ионообменники на основе целлюлозы или других гидрофильных полимеров, например диэтиламиноэтилцеллюло-зу (ДЭАЭ-целлюлоза), содержащую катионные группы, или карбоксиметилцел-люлозу (КМ-целлюлоза), содержащую анионные группы (рис. 1.31).
Прочность связывания белков с ДЭАЭ-целлюлозой тем выше, чем больше в молекуле белка карбоксильных групп.