Проведение полимеразной цепной реакции
Реакция проходит в три стадии.
1. Инкубационную смесь нагревают до 90 °С. При этом происходит денатурация ДНК, из одной двухцепочечной молекулы образуются две одноцепо-чечные.
2. Инкубационную смесь охлаждают до 50 °С. При этом происходит гибридизация цепей с затравками.
3. Инкубационную смесь нагревают до 70 °С. При этой температуре гибридные молекулы не денатурируются, а ДНК-полимераза удлиняет обе затравки с их З'-концов до 5'-концов матричных цепей. В результате образуются две новые цепи ДНК, укороченные с 5'-концов; при этом затравка оказывается включенной в эти укороченные цепи молекул ДНК.
- Полимеразная цепная реакция.
Концентрация каждой затравки должна значительно превышать концентрацию ДНК. В противном случае во время стадии 2 высока вероятность того, что разделенные цепи ДНК будут соединяться не с затравкой, а друг с другом. Кроме того, как уже отмечено, затравки остаются в составе вновь синтезированной ДНК, т. е. расходуются во время реакции.
Затем цикл смены температур повторяют. Во втором цикле происходят те же события, что и в первом, но кроме того используются в качестве матриц укороченные цепи, образовавшиеся в первом цикле: эти цепи еще раз укорачиваются (с З'-концов), и образуются цепи, содержащие только последовательность нуклеотидов искомого гена (цикл 2, цепь, выделенная штриховкой). В цикле 2 показаны превращения молекулы А, образовавшейся в цикле 1; аналогичным превращениям подвергается и молекула Б.
В следующем (третьем) цикле смены температур снова происходят те же события, что и в первых двух циклах, но кроме того используются в качестве матрицы цепи, содержащие только последовательность нуклеотидов искомого гена; в результате получается двухцепочечная молекула (выделена штриховкой), содержащая только ген данного белка.
Далее цикл смены температур повторяют многократно, и в каждом цикле (начиная с четвертого) происходит репликация гена, т. е. удвоение его количества в инкубационной смеси. Реакция протекает быстро, каждый трехстадийный цикл занимает около трех минут, за один час можно провести 20 циклов. Количество ДНК нарастает в геометрической прогрессии со множителем 2: за п циклов оно будет равно 2п; за 20 циклов увеличится примерно в миллион раз.
Поскольку матрица при матричном синтезе не расходуется, то исходная ДНК, внесенная в инкубационную смесь, в каждом цикле используется для синтеза укороченных с 5'-конца цепей (см. рис. 4.24, цикл 1). Количество этих матриц нарастает, однако не в геометрической, а в арифметической прогрессии, и через 20 циклов увеличивается примерно в 20 раз, что ничтожно мало по сравнению с миллионнократным увеличением количества гена.
Высокая эффективность ПЦР позволяет накопить необходимое количество ДНК при очень малых исходных количествах — достаточно одной капли крови, одного волоса, даже одной клетки или одной молекулы ДНК. Метод ПЦР резко ускорил изучение генома человека, и нашел практическое применение для диагностики болезней (ДНК-диагностика), а также для идентификации личности.
В частности, ПЦР применяют для диагностики инфекционных болезней. Традиционная диагностика таких болезней основана на использовании микробиологических методов, которые часто требуют гораздо больше времени и менее надежны, чем ДНК-диагностика. Метод основан на том, что первичная структура ДНК разных видов организмов различна. Следовательно, можно подобрать такие затравки, которые будут гибридизоваться с ДНК возбудителя, но не с ДНК человека. Если, используя эти затравки, провести ПЦР с материалом (кровь, биопсийный материал), полученным от больного, то нарастание количества ДНК в пробе будет указывать на наличие возбудителя в организме пациента: в ПЦР будет синтезироваться только ДНК возбудителя, а не пациента.
Вирусы, для которых характерен длительный латентный период (например, вирус иммунодефицита человека), трудно обнаружить на ранних стадиях развития инфекции. С помощью ПЦР это удается сделать даже тогда, когда вирус содержится лишь в незначительной части клеток организма.