Рубрика ‘Биологическая химия’
Цель курса биохимии — научить будущих врачей применять при изучении последующих дисциплин и в профессиональной врачебной деятельности сведения о химическом составе и молекулярных процессах организма как о характеристиках нормы и признаках патологии. Исходя из этого, в предлагаемом издании особое внимание уделяется сведениям о непосредственной связи молекулярных процессов с физиологическими (биологическими) функциями клетки и организма. Например, с этой точки зрения один из центральных вопросов общей биохимии — о механизмах ферментативного катализа — представляется нам менее важным, чем вопрос о субстратной специфичности и многообразии ферментов в организме.
Сведения о молекулярных механизмах патогенеза болезней, имеющиеся в каждой главе, выполняют не только информативную, но и мотивационную роль, поскольку подчеркивают значение биохимии для изучения клинических дисциплин и для будущей профессиональной деятельности. Вместе с тем биохимия должна сохранять характер фундаментальной дисциплины, составляя вместе с другими медико-биологическими дисциплинами теоретическую основу медицины.
Как используется знание медико-биологических дисциплин в практической деятельности врача? Установление диагноза болезни и назначение адекватного лечения включают ряд мыслительных операций, начиная с отбора симптомов из многих тысяч диагностических признаков, известных современной медицине. Отобранные симптомы складываются в клиническую картину, на основе которой делают заключение о сущности болезни и, наконец, устанавливают диагноз страдания конкретного больного, служащий базой для определения методов лечения. При этом мысль врача постоянно возвращается от последующего этапа к предыдущему и корректируется путем сопоставления промежуточных заключений. Центральную роль в этом процессе играют образы сущности болезней, имеющиеся в памяти врача. Они служат главным ориентиром и в движении к диагнозу, и в движении от диагноза к способам лечения. А сущности болезней, равно как мишени и механизмы действия лекарств и лечебных мероприятий, описываются в терминах и понятиях морфологии, физиологии и биохимии. При этом клиницисту требуется интегральное описание морфологии, физиологии и биохимии патологических состояний: нет такой функции и нет такой болезни, которые можно было бы описать в рамках одной или двух из этих дисциплин.
При составлении книги мы стремились подбирать такие факты, конкретные явления, частные приложения биохимии, на основе которых проще перейти к обобщениям, чтобы, исходя из них, можно было понимать и конструировать другие конкретные явления того же класса, составляющие содержание биохимии. Такой подход позволяет решить и проблему, связанную со старением информации. Современный врач вынужден не только знать тонкости своего дела, но и уметь ориентироваться в быстро меняющейся информационной обстановке. Знание основных концепций, закономерностей и методов биохимии помогает студенту (врачу) находить и понимать новую информацию по биохимии и применять ее для решения медицинских проблем.
При написании книги мы исходили из того, что будущие врачи, начинающие изучать биохимию, имеют запас знаний о молекулах и молекулярных процессах, полученный в средней школе и в курсах химических дисциплин, предшествующих или параллельных курсу биохимии. Поэтому мы в ряде случаев нарушали логику изложения химизма биохимических процессов, чтобы сохранить логику изложения их биологического смысла и значения.
Для читателя важно помнить, что в каждом очередном разделе содержится больше информации, чем можно извлечь при первом чтении, основываясь на знании только предшествующих разделов. Это обычная ситуация при описании сложных кооперативных систем, в которых все части образуют единое функциональное целое. Именно к таким системам относятся объекты биологии, в том числе биохимия человека.
Настоящее издание отражает результат многолетней эволюции преподавания биохимии в ММА. При подготовке нового издания учтены многочисленные и существенные изменения содержания биохимии за последние годы. В соответствии с этим внесены значительные изменения и в структуру учебника.
Биологическая химия изучает молекулярные процессы, лежащие в основе развития и функционирования организмов. Биохимия использует методы «молекулярных» наук — химии, физической химии, молекулярной физики, и в этом отношении биохимия сама является молекулярной наукой. Однако главные конечные задачи биохимии лежат в области биологии: она изучает закономерности биологической, а не химической формы движения материи. С другой стороны, «молекулярные изобретения» природы, открываемые биохимиками, находят применение в небиологических отраслях знания и в промышленности (молекулярная бионика, биотехнология). В таких случаях биохимия выступает в роли метода, а предметом исследований и разработок являются проблемы, выходящие за пределы биологии.
Место биохимии как молекулярного уровня биологических исследований иллюстрирует рис. В.1. Уровни исследования являются отражением уровней структурной организации биологических систем, образующих иерархический ряд от наиболее простых систем (молекулы организмов, молекулярный уровень) до предельно сложной земной биологической системы (биосферный уровень). Действительные связи между отраслями биологии гораздо сложнее, чем можно представить с помощью таких простых схем, как на рис. В.1. В частности, каждый более простой уровень организации живых систем (и, соответственно, уровень их исследования) является частью более сложных уровней. Самый первый уровень — молекулярный — уникален в том отношении, что он является составной частью систем всех других уровней биологии. Соответственно этому выделяют такие разделы биохимии, как, например, молекулярная генетика, биохимическая экология. Высший уровень — биосферный — включает в себя все другие уровни.
Первоначальные этапы истории биохимии совпадают с историей органической химии. До середины XIX в. органической химией называли науку, которая изучала вещества, входящие в состав животных и растительных организмов, т. е. вещества живого («органического») мира. Позднее, в связи с развитием синтетической химии соединений углерода, смысл термина «органическая химия» изменился — так теперь называют химию соединений углерода, а науку, изучающую химический состав живых организмов и химические процессы, протекающие в них, стали называть физиологической, а затем биологической химией. Биологическая химия изучает не только органические, но и неорганические (минеральные) соединения, содержащиеся в организмах. Разумеется, и после этой дифференциации органической и биологической химии их развитие происходит в тесном взаимодействии, объединяемое множеством общих методов и общих задач.
Историю биохимии (и органической химии) принято отсчитывать с конца XVIII в., когда впервые были выделены из организмов в чистом виде некоторые соединения — мочевина, лимонная кислота, яблочная кислота и др. В то время еще не было представлений о строении этих веществ. Длительный период развития биохимии, вплоть до середины XX в., заполнен открытием все новых веществ в живой природе, исследованием их структуры и химических превращений в организмах. Важнейшими достижениями этого периода явилось установление общего плана строения главных биополимеров — белков и нуклеиновых кислот, и раскрытие основных путей химических превращений веществ в организмах (метаболизм). В этот же период произошла дальнейшая дифференциация биохимии: в ней стали выделять статическую биохимию, изучающую химический состав организмов; динамическую биохимию, изучающую метаболизм; функциональную биохимию, изучающую связь химических процессов с физиологическими (биологическими) функциями.
Середина XX столетия явилась переломным этапом в истории биохимии. Развитие молекулярного уровня исследований в последующее время привело к перестройке структуры не только биохимии, но и всей биологии — ее методов, эмпирической основы, теоретических элементов, форм практического использования, классификации разделов биологии.
Отличительной чертой биохимии этого периода является переход к широкому изучению структуры и свойств индивидуальных представителей белков и нуклеиновых кислот, к выяснению функции каждого индивидуального белка и каждой функциональной единицы нуклеиновых кислот в живой клетке. Предпосылкой для этого послужило стремительное развитие методов разделения веществ и изучения их структуры, а также специфических для биохимии методов выделения и исследования надмолекулярных структур — клеточных органелл. Если в предшествующий период функциональная биохимия только зарождалась, то теперь она становится ведущим направлением в биохимии. По-прежнему сохраняются и усиливаются связи с органической химией, но одновременно резко возрастает значение связей биохимии с другими биологическими науками — цитологией, физиологией, генетикой. Наиболее ярким выражением этого явилось раскрытие молекулярных механизмов таких фундаментальных свойств жизни, как наследственность и изменчивость.
В 50-60-х годах XX в., когда была установлена структура ДНК, позволившая объяснить механизм репликации генов, возникло новое название для обозначения этого направления исследований — молекулярная биология. Первоначально молекулярной биологией называли область биохимии, изучающую молекулярные основы общебиологических явлений — наследственности, изменчивости, биологической эволюции. Однако очень скоро значение термина изменилось, и его стали применять в более широком смысле, вплоть до того, что некоторые биохимики считают термины «молекулярная биология» и «биохимия» синонимами.
До середины XX в. в биохимии преобладало исследование химических превращений веществ в организме, сопровождающихся изменением ковалентной структуры соединений (метаболизм). Однако со временем выяснилось, что не меньшее значение в обмене веществ и функционировании организма имеют физико-химические процессы, не связанные с изменением ковал ентной структуры соединений. Область биохимии, изучающую физико-химические и молекулярно-физичес-кие основы жизнедеятельности, называют физико-химической биологией.
Всякое изменение молекул в организме можно изучать в двух направлениях. Одно направление — выяснение роли этого процесса для функционирования живой клетки, органа, организма. В этом случае молекулярные процессы служат для объяснения биологических явлений. Другое направление — выяснение химических и физических основ этого процесса, т. е. объяснение поведения молекул в организме исходя из законов химической и физической форм движения материи. Исследования этого направления составляет содержание биоорганической химии. Биоорганическая химия занимает положение, пограничное с органической химией, в отличие от которой изучает прежде всего те свойства соединения, которые непосредственно связаны с его функцией в организме. Кроме того, биоорганическая химия, исходя из функций отдельных соединений в организме и механизма их действия, разрабатывает принципы создания синтетических биологически активных соединений, т. е. веществ, определенным образом изменяющих функции организма (лекарства, избирательно действующие инсектициды и др.).
Здесь названы основные направления биохимии, имеющие общебиологическое значение. Кроме того, в зависимости от конкретных объектов и задач исследования выделяют и другие разделы биохимии, например: биохимия вирусов, биохимия растений, биохимия животных.
Представление о белках как о классе соединений формировалось в XVIII-XIX вв. В этот период из разнообразных объектов живого мира (семена и соки растений, мышцы, хрусталик глаза, кровь, молоко и т. п.) были выделены вещества, обладающие сходными свойствами: они образовывали вязкие, клейкие растворы, свертывались при нагревании, при их высушивании получалась роговидная масса, при «анализе огнем» ощущался запах паленой шерсти или рога и выделялся аммиак. Поскольку все эти свойства ранее были известны для яичного белка, то новый класс веществ получил название белков.
В начале XIX в. появились более совершенные методы элементного анализа веществ и начались исследования элементного состава белков. В последних обнаружили углерод, водород, азот, кислород, серу и фосфор. Голландский химик и врач Г. Я. Мульдер (1802-1880) предложил первую теорию строения белков. Исходя из исследований элементного состава, Мульдер пришел к выводу, что все белки содержат одну или несколько групп (радикалов) C40H62N10O2, соединенных с серой или фосфором или с тем и другим вместе. Он предложил для обозначения этой группы термин «протеин» (от греч. протейон — первый), так как считал, что это вещество «без сомнения, важнейшее из всех известных тел органического царства, и без него, как кажется, не может быть жизни на нашей планете»*.
Представление о существовании такой группы скоро было опровергнуто, а значение термина «протеины» изменилось, и сейчас он применяется как синоним термина «белки».
Важную роль в изучении структуры белков сыграло развитие методов их разложения кислотами и пищеварительными соками. В 1820 г. А. Браконно (Франция) подвергал многочасовому действию серной кислоты кожу и другие ткани животных, затем нейтрализовал смесь, получал фильтрат, при выпаривании которого выпадали кристаллы вещества, названного им гликоколом («клеевым сахаром»). Это была первая аминокислота, выделенная из белков. Ее структурная формула установлена в 1846 г.К концу XIX в. из белков было выделено свыше десяти аминокислот. Исходя из результатов изучения продуктов гидролиза белков, немецкий химик Э. Фишер (1852-1919) предположил, что белки построены из аминокислот. Это положение послужило основанием для его многолетних исследований химии аминокислот и белков, завершившихся созданием в начале XX в. пептидной теории строения белков. В результате работ Э. Фишера стало ясно, что белки представляют собой линейные полимеры а-аминокислот, соединенных друг с другом амидной (пептидной) связью, а все многообразие представителей этого класса соединений могло быть объяснено различиями аминокислотного состава и порядка чередования разных аминокислот в цепи полимера. Однако эта точка зрения не сразу получила всеобщее признание: еще в течение трех десятилетий появлялись иные теории строения белков, в частности такие, которые основывались на представлении, что аминокислоты не являются структурными элементами белков, а образуются как вторичные продукты при разложении белков в присутствии кислот или щелочей.
Первые исследования белков проводились со сложными белковыми смесями, такими, как яичный белок, сыворотка крови, экстракты из растительных и животных тканей, а подчас и цельные ткани. Лишь в конце XIX в. получили распространение методы разделения белков с помощью осаждения нейтральными солями. В 30-е годы XX в. были получены первые белки в кристаллическом состоянии. Получение вещества в кристаллическом виде служит одним из надежных доказательств чистоты (гомогенности) препарата. В частности, в 1926 г. Д. Самнер выделил из семян канавалии белок (фермент) уреазу в кристаллическом состоянии; Д. Нортроп и М. Кунитц в 1930-1931 гг. получили кристаллы пепсина и трипсина. После этих пионерских работ выделение индивидуальных белков стало частым событием в истории биохимии, особенно после 50-х годов, когда начали применять современные методы фракционирования — хроматографию на гидрофильных ионообменниках, гель-фильтрацию («молекулярное просеивание»), новые методы электрофореза и др.
На современном этапе изучения белков основными направлениями являются следующие:
1) изучение пространственной структуры индивидуальных белков;
2) изучение механизмов функционирования индивидуальных белков (на уровне отдельных атомов и атомных групп молекулы белка);
3) изучение интегративной функции наборов белков, характерных для тех или иных субклеточных структур или типов клеток, а также для интегральных биохимических систем более высокого уровня, вплоть до целого организма и популяции организмов.
Мономерами белков служат а-аминокислоты, общим признаком которых является наличие карбоксильной группы и аминогруппы у второго углеродного атома (а-углеродный атом) Мономерами белков служат а-аминокислоты, общим признаком которых является наличие карбоксильной группы и аминогруппы у второго углеродного атома (а-углеродный атом) Встречающиеся в живой природе а-аминокислоты, как правило, имеют L-koh-фигурацию. Однако в клетках многих микроорганизмов есть и D-аминокислоты, в частности в веществе клеточной стенки и в составе некоторых антибиотиков.
В водной среде аминокислоты находятся в ионизированной форме. При рН=7, характерном для жидкостей организма, ионизированы ос-аминогруппы и ос-карбоксильные группы всех аминокислот, со-карбоксильные группы аспарагиновой и глу-таминовой кислот, е-аминогруппа лизина.
Даже при одинаковой длине пептиды являются разными веществами, если они различаются по аминокислотному составу.В первом из них есть остатки лизина, глицина и серина, которых нет во втором. В то же время во втором есть остатки изолейцина, аспарагиновой кислоты и тирозина, которых нет в первом. Эти два вещества существенно различаются по химическим свойствам и разительно — по биологическим свойствам: каллидин — это гормон местного действия, регулирующий тонус кровеносных сосудов и проницаемость капилляров, а ангиотензин I физиологически нейтрален,но служит предшественником другого пептида — ангиотензина II, регулирующего кровяное давление.В нейтральной среде эта реакция протекает очень медленно, но ускоряется в присутствии кислот и щелочей. Обычно гидролиз белков проводят в запаянной ампуле в растворе соляной кислоты (6 моль/л) при 105 °С; в таких условиях полный распад происходит примерно за сутки. Затем аминокислоты гидролизата разделяют методом хроматографии на ионообменных смолах, выделяя отдельно каждую аминокислоту.В этой реакции бесцветный нингидрин превращается в продукт красно-фиолетового цвета. Измерив интенсивность окрашивания, можно рассчитать концентрацию каждой аминокислоты в гидролизате и число остатков каждой из аминокислот в исследуемом белке. Такой анализ проводят с помощью автоматических приборов — аминокислотных анализаторов (рис. 1.5). В прибор загружают гид-ролизат белка, и все остальные операции производятся автоматически. Результат анализа прибор выдает в виде графика концентраций отдельных аминокислот.
Первичной структурой называют порядок чередования (последовательность) аминокислотных остатков в белке. Даже идентичные по длине и аминокислотному составу пептиды могут быть разными веществами. Например, из двух аминокислот — аланина и тирозина — можно построить два пептида: Ala—Туг и Туг—Ala. Из трех аминокислот можно получить шесть различных по первичной структуре трипептидов. Число изомеров полипептида, построенного из п разных аминокислот, равно числу перестановок из п элементов, т. е. п\ При п = 20 число возможных изомеров равно 2«1018. Если учесть, что в составе пептидной цепи каждая из аминокислот может встречаться больше одного раза, то число изомеров становится невообразимым. Возможность составления разных белков из аминокислот так же неисчерпаема, как возможность составления разных фраз из букв алфавита. Однако в живой природе реализуются не все эти возможности. В организме человека, по приближенным оценкам, имеется около 50 ООО разных белков.После реакции выделяют ФТГ—к и идентифицируют его; допустим, он оказался фенилтиогидантоином аланина. Теперь мы можем записать последовательность исследуемого тетрапептида так: Ala—1—m—п. Затем таким же образом исследуют оставшийся после первой реакции трипептид 1—m—п и узнают второй аминокислотный остаток, и т. д. Созданы автоматические приборы — секвенато-ры, позволяющие с использованием этой реакции изучать первичную структуру карбоксильной группой метионина и аминогруппой любой другой аминокислоты. При обработке бромцианом в молекуле белка разрушаются все такие связи и образуется соответствующее число фрагментов. Для фрагментирования применяют также некоторые ферменты, избирательно гидролизующие определенные пептидные связи.
Пептидная цепь обладает значительной гибкостью. В результате внутрицепочеч-ных взаимодействий она приобретает определенную пространственную структуру (конформацию). Основным методом изучения трехмерной структуры белков
служит рентгеноструктурный анализ. Он основан на дифракции и интерференции рентгеновских лучей, проходящих через кристалл изучаемого вещества. Молекулы, а следовательно, и атомы, входящие в эти молекулы, в кристалле занимают фиксированное положение. Рентгеновы лучи при прохождении через кристалл поглощаются электронами, которые сами становятся вторичными излучателями. Расположение и интенсивность этих пятен зависят от распределения скоплений электронов в кристалле. Поскольку скопления электронов имеются в атомах, то можно сказать, что расположение пятен определяется расположением атомов в анализируемом кристалле. С помощью серии таких рентгенограмм можно рассчитать положение каждого атома в кристалле, а следовательно, и пространственное расположение аминокислотных остатков в молекуле белка
Вторичная структура белков обусловлена прежде всего свойствами пептидного остова. Карбонильная группа и NH-группа способны образовывать водородную связь между собой:Минимуму свободной энергии соответствует такое состояние пептида, когда все эти группы связаны водородной связью. Иначе говоря, пептид стремится принять конформацию с максимумом водородных связей. С другой стороны, возможности пространственной укладки пептидной цепи ограничиваются тем, что пептидная связь имеет частично двойной характер, и поэтому вращение вокруг нее невозможно. Атомы кислорода и водорода пептидной группы занимают трансположение. Напротив, вокруг обеих связей группы —СН— пептидного остова возможно свободное вращениеследствие этих ограничений при образовании водородных связей пептидная цепь принимает не произвольную, а строго определенную конформацию.
Известны три основных типа вторичной структуры пептидных цепей: ос-спираль, р-структура (складчатый слой, складчатый листок) и беспорядочный клубок.В а-спирали NH-группа данного остатка аминокислоты взаимодействует с СО-группой четвертого от него остатка. В результате пептидный остов образует спираль, на каждый виток которой приходится 3,6 аминокислотного остатка. Водородные связи ориентированы вдоль оси спирали, соединяя ее витки
Некоторые участки пептидной цепи не имеют какой-либо правильной, периодической пространственной организации: их обозначают как беспорядочный клубок. Однако такие участки в каждом белке имеют свою фиксированную конфор-мацию, которая определяется аминокислотным составом этого участка, а также вторичной и третичной структурами смежных областей, окружающих «беспорядочный клубок». Тем не менее в областях беспорядочного клубка пептидная цепь может сравнительно легко изгибаться, изменять конформацию, в то время как спирали и складчатый слой представляют собой достаточно жесткие структуры.Еще одна форма вторичной структуры обозначается как (3-поворот. Эту структуру образуют 4 (или больше) аминокислотных остатка с водородной связью между первым и четвертым, причем таким образом, что пептидная цепь меняет направление на 180° (рис. 1.14). В результате (3-поворота образуются антипараллельные сегменты пептидной цепи. (3-поворот часто встречается как элемент (3-структуры, а также между а-спи-ральными участками разной направленности.